Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.
Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.
卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤在美国的发病率和死亡率是本病的高复发,化疗耐药特点的主要原因。初级处理通常包括最大减灭术和随后的基于铂的治疗,虽然有一些证据表明新辅助治疗可能是有益的在某些情况下,1。广大患者积极响应基层处理,但遗憾的是上半年将在18个月2内复发。
大多数卵巢恶性肿瘤是上皮癌,可能起源于卵巢或输卵管3,4的表面上皮。几项研究支持体干细胞在雌性生殖系统中大概有助于所需要以下排卵5,6组织修复的存在。在两个过程中ovul卵巢和输卵管的高增殖活性ATION可能是在卵巢癌的发展的一个重要因素(Gharwan 等人提交的手稿)。肿瘤形成细胞的推导是不明的,但它们可以通过使它们无法调节除法或命运突变源自正常干细胞,祖细胞,或分化细胞。这些细胞也被称为“肿瘤干细胞”或“肿瘤起始细胞”,并能长成低附着条件下致瘤,多细胞球状体。尽管TIC发展的层次模型可以是动态的,信托之间有很多共同的相同的功能,正常干细胞,包括静止,化疗耐药,长期的自我更新和分化成各种细胞谱系7,8能力。
几个研究支持抽动存在于卵巢癌和当前正在努力以澄清机制(多个),以使这些细胞支持肿瘤9-11。几种标记物已被提出,以确定卵巢国际信托具有增强的致瘤性,包括CD133,ALDH1A1,CD117,CD44,和MyD88的,虽然每个标志物的确切贡献是不清楚,可能是特定11-16细胞类型。而通用的标记物或一组标志物还没有得到明确证实卵巢抽搐不同群体已通过选择CD44 +,CD133 +和/或细胞以高醛脱氢酶(ALDH)活性13,17-21分离卵巢国际信托更常见。 CD44是一种跨膜糖蛋白,其充当受体透明质酸和调节对肿瘤进展,包括粘附,增殖,迁移,血管发生和分化22重要的几个过程。 CD133是一种跨膜糖蛋白,其功能目前还不清楚,但研究表明,它组织细胞膜拓扑23。 ALDH,其催化醛氧化的胞内酶,可能是最UNIVERS国际信托作为高活性的人标记已被确定在干细胞从多种组织和多个角色的分离已被归因于ALDH在支持正常干细胞和国际信托24。截至目前,CD133和ALDH1似乎是卵巢TICS资本流动13,21的重现性最好的标记。
除了要了解TICS资本流动的特点,也有大的努力,以确定药物,专门针对这一亚群。与卵巢癌相关的高复发率,可能是由于目前的化疗未能成功地根除国际信托。虽然大部分肿瘤易受现有疗法,信托被认为是耐在不可检测通过标准方法的密度。治疗性肿瘤复发阐明机制,以提高反应和卵巢癌患者生存率的关键。
在这里,养殖技术介绍日在充实,从建立和原发性卵巢癌细胞系TICS资本流动。本文所述的培养条件下已经使用几组来诱导国际信托或球体的细胞与干细胞质量11,12,14,16,20的传播。虽然有几种干细胞培养媒体和补充通常用于富集抽搐/球体,我们使用用EGF和FGF一个无血清培养基配方,但不加B27或N-2补充剂。这些补充剂,通常用于神经元细胞培养和富集干细胞,已显示出促进间质表型25,26和仍然在该领域有一些不确定性,以具有间充质或上皮表型国际信托是否更致瘤性27-29 。为了最大限度地减少不确定性和变数,我们选择使用最常见的公式,因为我们正在处理的上皮卵巢癌细胞。
维持细胞在无血清培养基中的低附着烧瓶便于球体形成并支持细胞与CD133的表达和高ALDH活性的繁殖。我们的工作已进一步表明,细胞正常粘附的条件下浮动也可以代表一个更致瘤的TIC的人口。注射在这些条件下进无胸腺裸鼠中生长的细胞的引出相比生长在所附的条件在血清的存在下的细胞更高的致瘤潜力。关于抽动在卵巢癌起始,进展,治疗反应和疾病复发的作用多的信息可以通过使用这些技术来获得。
此处所描述的协议提供了一个有效的和一致的富集培养物为细胞从既定卵巢癌细胞系干细胞的特性的方法,并且适用于初级患者样品。这种方法成功地富集用于在各种细胞系国际信托。它可以及时识别,丰富的TIC和/或致瘤表型的条件下,没有考虑时间从内人口非TICS资本流动的TICS资本流动物理排序。以这种方式,不同的信号传导途径的相对水平可以评估其通过比较传统粘附培养到TIC使用各种功能测定培养物的TIC表型贡献。如果纯TIC人口是期望的,隔离可以容易地通过将在流式细胞协议的流程的荧光辅助或磁分选步骤实现的。
它,要记住,但是这是非常重要的TIC标志物的表达S,如CD133,CD44,或ALDH,可能其中的细胞系或患者样本甚至相同肿瘤类型的不同而不同。例如,我们发现,OVCAR-5细胞具有CD44的相对于CD133的高表达,而逆为真ACI-23。因此,有针对性依靠小鼠肿瘤发生和流式细胞仪分析,最终的TIC存在。按照此协议,高ALDH活性物一致时观察到卵巢癌细胞生长在干细胞的条件。有趣的是,CD133的表达是在传统文化的TIC条件下生长的ACI-23细胞持续走高,而ALDH最高的是浮子TIC条件。相比之下,TGS-3主要腹水细胞显示CD133阳性小幅增加浮子TIC条件下,但在ALDH活性传统TIC条件下显着增加。这些发现强调卵巢癌细胞的异质性,而且经常抽动关联的可塑性。为了进一步支持劳委会即时通讯,这些方法提高抽搐,也观察到TRA-1-60阳性细胞富集。 TRA-1-60是一种多能性标记物,并已被用于识别卵巢胚胎癌和睾丸以及前列腺癌TICS 30-32。虽然我们的方法已被成功地与众多的细胞系,这是可能的,标准的TIC条件可能更适合于一些卵巢癌细胞,而修改后的浮动条件更好的为在其他卵巢癌的细胞群国际信托充实。这再次强调了两个病人衍生的和建立的卵巢癌细胞系中的预期的异质性。
除了 细胞表面标记有已被证明以表征卵巢癌国际信托包括Nanog的,SOX2,Oct-4的11多种转录因子,尽管这些标记是不特定于卵巢癌抽动和相当代表因子为胚胎干细胞多能性的重要和DIFferentiation 33,34。我们研究了改变这些因素的蛋白水平,发现Nanog的水平在TIC培养条件增加,在与他人13,35以及CD133,TRA-1-60,和CD117的协议。一个人类干细胞标记基因芯片进一步表明相对于传统的附着条件增加CD133,Nanog的,梅尔克和PODXL基因在TIC条件。重要的是,应该指出的是,作为与细胞表面标记物,与卵巢国际信托相关的转录因子可之间的细胞系和患者样品而异。
我们已观察到,细胞可以是更致瘤性和表达更高水平的干细胞标记物,如果他们是固有非粘附在体外 ( 即漂浮细胞不容易附着到粘附片)。在培养细胞系如ACI-23通常具有下传统文化康迪特生长垂直于堆叠方式许多可行的漂浮细胞和/或细胞离子。虽然从漂浮细胞和聚集抽动成功富集可能适用于相对少的细胞系,包括那些在本研究和OVCAR-3 12,我们的研究结果表明,这可能代表了一种更致瘤的人口。因此,收获培养在标准组织培养板和介质可作为TIC富集的替代方法,对于细胞适应不良商业干细胞培养基的细胞的“浮动”人口。
使用本稿件提出不同的培养方法将使TIC人群的快速致富,并更好地了解是什么因素支持这种表型在不同的细胞。这种方法的当前应用包括表征该信号通路是至关重要,以支持细胞的这种独特的人口的繁殖。这些研究结果将有助于澄清肿瘤进展和复发的机制。
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
Epidermal Growth Factor – human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning cellgro | 25-056-CI | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Gemini | 100-106 | |
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) | Nalgene | 450-0045 | |
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |