Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
Transformada de Fourier de alta definição infravermelho (FT-IR) imagens espectroscópicas é uma abordagem emergente para obter imagens detalhadas que associou informação bioquímica. Imagiologia de FT-IR de tecido é baseado no princípio de que as diferentes regiões do infravermelho médio são absorvidos por ligações químicas diferentes (por exemplo, C = O, CH, NH) no interior das células ou tecidos, que pode então ser relacionados com a presença e composição de biomoléculas (por exemplo, lípidos, ADN, glicogénio, a proteína, o colagénio). Em uma imagem de FT-IR, cada pixel na imagem compreende todo um espectro de infravermelhos (IV) que pode dar informação sobre o estado bioquímico das células que podem então ser exploradas para o tipo de célula ou tipo-classificação da doença. Neste artigo, vamos mostrar: como obter imagens IR a partir de tecidos humanos, por meio de um sistema de FT-IR, como modificar a instrumentação existente para permitir capacidades de imagem de alta definição, e como visualizar imagens FT-IR. Em seguida, apresentamos algumas aplicações de FT-IRpara patologia usando o fígado e rim como exemplos. Imaging FT-IR detém aplicações interessantes em proporcionar uma nova rota para obter informações bioquímica das células e tecidos em uma rota não perturbando inteiramente livre-label no sentido de dar uma nova visão sobre mudanças biomoleculares como parte de processos de doença. Além disso, esta informação bioquímica pode potencialmente permitir a análise objectiva e automatizada de certos aspectos de diagnóstico da doença.
Espectroscopia no infravermelho tem sido uma ferramenta analítica disponível de alguma forma desde a década de 1930; no entanto, é apenas sido na última década que a área da imagiologia tecido com FT-IR explodiu. Os avanços na FT-IR para imagens de tecidos têm sido impulsionado em grande parte por três desenvolvimentos principais: 1) aumento da velocidade de aquisição de dados, devido à disponibilidade de grande matriz de plano focal (FPA) detectores que tipicamente têm milhares de detectores sensíveis IR 1 , 2, 2) desenvolvimento de algoritmos de processamento avançados e poder computacional para lidar com grandes volumes de dados hiperespectrais define 3, e 3) a modelagem de sistemas de imagens FT-IR para maximizar a resolução espacial de 4,5. Houve inúmeros alta qualidade e muito extensos artigos de revisão no campo da espectroscopia FT-IR recentemente 6-16, além de um artigo da Nature Protocols que detalha as etapas para a obtenção de espectros de ponto ou mapas a partir de tecidos 17. Neste artigo, vamos nos concentrar no protOCOL a obtenção de imagens de tecidos, utilizando um detector de 128 x 128 FPA num sistema de FT-IR modificado com capacidades de alta definição.
Imagiologia de FT-IV tem sido sugerida como um instrumento potencialmente desejável para a célula e imagiologia do tecido devido à capacidade de obtenção de imagens, em que cada pixel tem uma riqueza de informação bioquímica. FT-IR de imagem baseia-se no princípio de que em diferentes biomoléculas de uma amostra irá absorver quantitativamente diferentes regiões do infravermelho médio; isto permite a derivação de uma "impressão digital bioquímica '. Esta impressão digital tinha sido demonstrado em vários estudos para alterar entre diferentes tipos de células e estados de doença. Ao contrário da prática convencional, em que a patologia manchas de imuno-histoquímica e marcadores necessitam de ser utilizada para visualizar e identificar os tipos de células e estruturas de tecidos que são utilizados para guiar as possibilidades de diagnóstico e tratamento, as imagens de FT-IR são formados com base na bioquímica inerente do tecido. O techniq atualue de tecido de coloração para o diagnóstico é demorado, destrutivo, trabalhoso e requer experiência subjetiva do patologista, enquanto FT-IR oferece o potencial para tornar esse processo rápido, não destrutivo, altamente automatizado, e mais objetiva. Além disso, FT-IR proporciona uma nova via para a obtenção de informação bioquímica adicional que pode não estar prontamente acessíveis usando técnicas de coloração convencionais.
Um dos avanços mais excitantes nos últimos anos tem sido a disponibilidade de métodos de imagem de alta resolução que podem agora permitem a visualização e caracterização dos tipos de células e estruturas de tecidos que são críticos para o diagnóstico de doença global. Uma dessas técnicas é a reflectância total atenuada (ATR) FT-IR que incorpora uma lente de imersão em sólido (SIL) de um índice de refracção elevado, que permite a alta resolução de imagem 18, com os diversos estudos muito interessantes mostrando as suas aplicações 19-25. Além disso, wcomo recentemente demonstrado que o aumento da resolução espacial associado com ATR imagem pode permitir a visualização e classificação de células endoteliais e mioepiteliais no tecido mamário que formam um componente-chave do diagnóstico de câncer de mama 26. Enquanto ATR imagem é muito útil, esta técnica requer o SIL para fazer contato com o tecido para formar imagens FT-IR; portanto, seu uso é um pouco limitado para a patologia do tecido onde grandes regiões de tecidos devem ser rapidamente trabalhada.
Uma segunda abordagem foi demonstrada por acoplamento de um objectivo de grande ampliação de um sistema de FT-IR existente que usa um sincrotrão como uma fonte luminosa de infravermelhos, é possível iluminar completamente FPA e uma imagem com um tamanho efectivo de pixels de 0,54 x 0,54 mm. Isto permitiu-nos visualizar estruturas-chave em tecidos da mama e da próstata que não foram resolvido utilizando sistemas de 4 FT-IR convencionais. Embora estes aumentos dramáticos na imagem IR resolutio espacialn foram emocionantes, a sua utilização permaneceu limitada devido à necessidade de um síncrotron. Posteriormente, um sistema ótimo foi projetado que poderia permitir também a capacidade de imagem de alta definição com um tamanho de pixel de 1,1 x 1,1 mm, sem a exigência de uma fonte síncrotron, mas sim através de uma fonte IR globar tradicional 5. Neste artigo, vamos mostrar como modificar um sistema de imagem existente comercial FT-IR para permitir a difração de IR limitada imagem de tecidos com um sinal aceitável para ruído utilizando múltiplos objetivos IR (15X, 36X, e 74x). O tamanho efectivo de pixels com os três objectivos é de 5,5 x 5,5 mm (15X), 2.2 x 2.2 mm (36X) e 1,1 x 1,1 mm (74x). Nós, então, dar alguns exemplos da importância dos ganhos de resolução espacial para a detecção de doenças no fígado e rins 27 biópsias.
FT-IR é uma modalidade emergente de livre-label imaging bioquímica de cortes de tecidos, com o potencial de ter um papel importante na melhoria do padrão atual de diagnóstico em patologia. O padrão ouro atual para a patologia requer tecidos para a biópsia, fixados em formol, embebidos em parafina, seccionados várias vezes, e corados com várias manchas. Um patologista altamente treinados tem de avaliar subjetivamente visualmente a estrutura do tecido e morfologia celular, para determinar um diagnóstico. Aqui nós mostramos como coletar imagens de infravermelho de alta resolução a partir do mesmo tipo de seções e discutir algumas das abordagens computacionais para examinar as diferenças químicas entre os tipos de células e estados de doença.
Os passos críticos dentro deste protocolo são para garantir que os tecidos são muito cuidadosamente focado e que o sistema está bem calibrado para garantir que os dados espectroscópicos de qualidade muito elevada. O cuidado ao configurar o sistema é particularmente criti cal quando se trabalha com objetivos de alta ampliação. Para ajudar na solução de problemas, a seguinte lista abrange alguns dos potenciais dificuldades encontradas;
Problema: intensidade IR Low na obtenção de imagens em reflexão. Solução: Verifique IR orientação slide como o revestimento reflexivo pode estar no lado errado do slide.
Problema: Baixo sinal de aviso / Red em Controle Lancer. Solução: detectores de frescos com LN2. O nitrogênio líquido é necessário para os detectores FPA para funcionar e requer periodicamente sendo tampo.
Erros de erro / movimento Velocity: problema. Solução: Repor espectrômetro e reduzir as vibrações. Vibrations fará com que o espelho se movendo no interferômetro de ser perturbado.
Problema: spikes vapor de água na dados. Solução: Aumentar a purga no sistema e proteger amostra de ar.
Problema: centerburst inválido. Solução: Encontre centerburst novamente.
e_content "> Problema:. diferença Baixo fluxo de transmissão, embora focado. Solução: Ajuste condensador inferior Isso ocorrerá quando a luz IR não está sendo focado para um ponto na amostra.Neste trabalho, temos nos concentrado em como adquirir imagens de alta definição de IR de tecidos em qualquer modo de transmissão ou de transflectância. A natureza das imagens de FT-IR, é que existem várias modificações que podem ser feitas para a aquisição de dados, tais como, o tipo de substrato, técnica de fixação, espessura da amostra, a resolução espectral, interferômetro velocidade espelho etc. O efeito desses parâmetros possui foi discutido em grande detalhe recentemente 4,5,17,51.
Há uma série de modificações que podem ser feitas para o sistema de imagem, incluindo imagens no modo ATR 10,24,26 e usando abordagens térmicas nanoescala 52,53 para permitir imagens de alta resolução IR. A principal limitação com alta resolução de imagem IR é que a tissues deve ser cuidadosamente preparada e fino o suficiente para IR de passar por (tipicamente 4 espessura mm). Além disso, a transmissão e reflectância de imagem de FT-IR requer as amostras a ser seca, devido à absorção de IV, pela água. No entanto, a imagem de FT-IR tem vantagens significativas sobre outras técnicas, em que ele pode rapidamente grandes áreas de imagem de tecido, enquanto que derivam informação bioquímica rico e detalhado. Outras técnicas similares que derivam informação bioquímica de uma forma livre de marcador incluem a espectroscopia de Raman, no entanto, o tempo de aquisição de dados é muito mais lento para aquisição de imagens. Abordagens de imagem New Raman estão surgindo incluindo Stimulated Raman (SRS) e coerente Antistokes espalhamento Raman (CARS); no entanto, eles têm acesso à gama espectral limitada ou de imagem de uma única frequência.
Os avanços na velocidade de aquisição de dados, resolução espacial, e disponibilidade de abordagens computacionais têm sido de enorme valor na tomada de imag FT-IRing uma abordagem mais viável para a tradução como uma nova ferramenta de imagem na patologia. Os recentes avanços na resolução espacial têm sido particularmente importante para a patologia do tecido devido à tipos de células-chave não sendo resolvido usando sistemas de imagem FT-IR convencionais. O artigo recente de Reddy et al. mostrou como modelar um sistema ideal para obter a resolução espacial óptima de um sistema de imagem de FT-IR 5. O exemplo de tecido renal apresentada neste artigo demonstra a importância de resoluções espaciais mais altas a fim de extrair informação bioquímica de estruturas glomerular (Figura 3 e Figura 5). No futuro, os novos avanços em Quantum Cascade Lasers fontes de luz IR como muito brilhantes 54-57, 3D imagem espectral 58, e avanços no campo das tecnologias em nanoescala IR 52,53,59,60 realizar novos caminhos de pesquisa que podem ter grandes implicações para o futuro da imagem do tecido.
<p clburro = "jove_content"> Nós apresentamos exemplos de aplicações em fígado e doença renal, onde há uma necessidade de informação bioquímica adicional que pode ser de valor diagnóstico. O Spectral Patologia Laboratório do Departamento de Patologia da Universidade de Illinois em Chicago é focada na tradução de tecnologias de imagem IR no sentido de melhorar o diagnóstico da doença e melhorou a previsão de evolução de pacientes. Imaging FT-IR pode superar algumas das limitações atuais na prática patologia onde a informação quantitativa e objetiva é necessária. Em particular, o trabalho futuro está focada na identificação de áreas em prática patologia atual em que as técnicas atuais não fornecem sensibilidade diagnóstica adequada ou fornecer informações limitadas. Existe uma clara necessidade em melhorar a prática atual de patologia e no sentido de dar mais informações para o patologista sobre o estado de doença de um paciente, que pode ser obtida através de alta definição de imagem FT-IR.The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |