Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
عالية الوضوح تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) التصوير الطيفي هو نهج الناشئة للحصول على صور مفصلة التي ترتبط المعلومات الكيميائية الحيوية. ويستند التصوير FT-IR من الأنسجة على مبدأ أن مناطق مختلفة من منتصف الأشعة تحت الحمراء يتم امتصاصها عن طريق روابط كيميائية مختلفة (على سبيل المثال، C = O، CH، NH) داخل الخلايا أو الأنسجة التي يمكن بعد ذلك أن تكون ذات صلة إلى وجود وتكوين من الجزيئات الحيوية (على سبيل المثال، والدهون، DNA، الجليكوجين، والبروتين، الكولاجين). في صورة FT-IR، كل بكسل في الصورة يتكون بأكمله الأشعة تحت الحمراء (IR) الطيف التي يمكن أن تعطي معلومات عن حالة البيوكيميائية للخلايا التي يمكن بعد ذلك استغلالها لخلية من نوع أو مرض من نوع التصنيف. في هذه الورقة، وتبين لنا: كيفية الحصول على صور الأشعة تحت الحمراء من الأنسجة البشرية باستخدام نظام FT-IR، وكيفية تعديل الأجهزة الموجودة للسماح للقدرات التصوير عالي الوضوح، وكيفية تصور الصور FT-IR. نحن بعد ذلك تقديم بعض التطبيقات من FT-IRلعلم الأمراض باستخدام الكبد والكلى على سبيل المثال. التصوير FT-IR يحمل تطبيقات مثيرة في توفير طريقا جديدا للحصول على المعلومات الحيوية من الخلايا والأنسجة في غير الاقلاق مسار تماما خالية من التسمية نحو إعطاء نظرة جديدة إلى تغييرات الجزيئية البيولوجية كجزء من عمليات المرض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه المعلومات الحيوية يحتمل يسمح للتحليل الموضوعي والآلي لبعض جوانب تشخيص الأمراض.
وكانت أطياف الأشعة تحت الحمراء أداة تحليلية المتوفرة في بعض شكل منذ 1930s. ومع ذلك، كان فقط خلال العقد الماضي أن مجال التصوير الأنسجة مع FT-IR قد انفجرت. وقد كان الدافع وراء التقدم في FT-IR لتصوير الأنسجة في جزء كبير من قبل ثلاثة تطورات رئيسية: 1) زيادة سرعة الحصول على البيانات نظرا لتوافر كبير صفيف المستوى البؤري (FPA) للكشف عن الذي عادة ما يكون الآلاف من الأشعة تحت الحمراء للكشف عن حساسية 1 ، 2، 2) تطوير خوارزميات المعالجة المتقدمة والقوة الحسابية لمعالجة البيانات الفائقة الطيفية كبيرة تحدد 3، و 3) نمذجة نظم التصوير FT-IR لتعظيم القرار المكانية 4،5. كانت هناك العديد من جودة عالية والمواد واسعة جدا إعادة النظر في مجال FT-IR الطيفي مؤخرا 6-16، بالإضافة إلى ورقة الطبيعة البروتوكولات التي تفاصيل الخطوات للحصول على الأطياف نقطة أو الخرائط من الأنسجة (17). في هذه الورقة، سوف نركز على البروتوكول الاضافيocol للحصول على صور من الأنسجة باستخدام 128 × 128 كاشف FPA في تعديل نظام FT-IR مع قدرات عالية الوضوح.
منذ فترة طويلة واقترح FT-IR التصوير ليكون أداة يحتمل أن تكون مرغوبة للخلية والتصوير الأنسجة بسبب القدرة على الحصول على الصور في كل بكسل التي لديها ثروة من المعلومات الحيوية. ويستند FT-IR التصوير على مبدأ أن الجزيئات الحيوية المختلفة في عينة سوف تمتص الكمية مناطق مختلفة من منتصف الأشعة تحت الحمراء. وهذا يسمح للاشتقاق من 'البصمة الكيميائية الحيوية ". قد تظهر هذه البصمات في العديد من الدراسات لتغيير بين أنواع مختلفة من الخلايا والحالات المرضية. خلافا لما حدث في ممارسة علم الأمراض التقليدية التي تحتاج فيها بقع وعلامات المناعى لاستخدامها لتصور وتحديد أنواع الخلايا والهياكل الأنسجة التي تستخدم لتوجيه خيارات التشخيص والعلاج، ويتم تشكيل الصور من FT-IR على أساس الكيمياء الحيوية المتأصل في الأنسجة. وTECHNIQ الحاليرق من الأنسجة تلطيخ للتشخيص هو مضيعة للوقت، مدمرة، شاقة، ويتطلب الخبرة الشخصية للالطبيب الشرعي، في حين FT-IR توفر إمكانية لجعل هذه العملية سريعة وغير مدمرة، الآلي للغاية، وأكثر من ذلك الهدف. وبالإضافة إلى ذلك، توفر FT-IR طريقا جديدا لحصول على معلومات إضافية البيوكيميائية التي قد لا تكون في متناول الجميع باستخدام تقنيات تلطيخ التقليدية.
كان واحدا من أكثر التطورات إثارة في السنوات الأخيرة توافر نهج عالية التصوير القرار الذي يمكن أن تسمح الآن لتصور وتوصيف أنواع الخلايا والهياكل الأنسجة التي تعتبر بالغة الأهمية لتشخيص شامل المرض. واحدة من هذه التقنيات هو الموهن إجمالي الانعكاس (ATR) FT-IR الذي يشتمل على عدسة الغمر الصلبة (SIL) من معامل الانكسار عالية والذي يسمح لارتفاع القرار التصوير 18، مع العديد من الدراسات المثيرة جدا تظهر تطبيقاتها 19-25. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه ثكما ثبت مؤخرا أن زيادة القرار المكانية المرتبطة ATR التصوير يمكن أن تسمح لتصور وتصنيف البطانية وخلايا عضلية ظهارية في أنسجة الثدي والتي تشكل عنصرا رئيسيا في تشخيص سرطان الثدي 26. في حين ATR التصوير مفيد جدا، وهذا الأسلوب يتطلب SIL لاجراء اتصالات مع الأنسجة لتشكيل الصور FT-IR. وبالتالي، واستخدامه يقتصر إلى حد ما لأمراض الأنسجة حيث مناطق واسعة من الأنسجة يجب تصويره بسرعة.
وقد تجلى نهج الثاني اقتران هدف تضخم عالية إلى النظام القائم FT-IR يستخدم السنكروترون كمصدر مشرق من الأشعة تحت الحمراء، فمن الممكن لإلقاء الضوء بالكامل على FPA وصورة مع حجم بكسل فعال من 0.54 X 0.54 ميكرون. هذا يسمح لنا لتصور الهياكل الرئيسية في الثدي والبروستاتا الأنسجة التي لم تكن للحل باستخدام أنظمة FT-IR التقليدية 4. في حين أن هذه الزيادات الكبيرة في صورة IR resolutio المكانيةن كانت مثيرة، وبقي استخدامها محدود بسبب تتطلب السنكروترون. وفي وقت لاحق، وقد تم تصميم نظام الأمثل والتي قد تسمح أيضا للقدرات التصوير عالية الوضوح مع حجم بكسل 1.1 X 1.1 ميكرون دون اشتراط وجود مصدر السنكروترون بل باستخدام مصدر IR globar التقليدية 5. في هذه المقالة، وتبين لنا كيفية تعديل نظام التصوير الموجودة التجاري FT-IR للسماح للحيود الأشعة تحت الحمراء محدودة التصوير من الأنسجة مع إشارة مقبولة إلى نسبة الضوضاء باستخدام الأشعة تحت الحمراء أهداف متعددة (15X، 36X، 74X و). حجم بكسل فعال مع الأهداف الثلاثة هي 5.5 × 5.5 ميكرون (15X)، 2.2 X 2.2 ميكرون (36X) و 1.1 X 1.1 ميكرون (74X). نحن ثم إعطاء بعض الأمثلة على أهمية المكاسب التي تحققت في التحليل المكاني للكشف عن المرض في الكبد والكلى الخزعات 27.
FT-IR هي طريقة الناشئة عن خالية من التسمية التصوير الكيمياء الحيوية من أقسام الأنسجة، مع احتمال أن يكون لها دور مهم في تحسين مستوى الحالي للتشخيص في علم الأمراض. المعيار الذهبي الحالي للأمراض الأنسجة يتطلب أن تحتاج فحص، ثابتة في الفورمالين، جزءا لا يتجزأ من البارافين، مقطوع عدة مرات، وملطخة البقع متعددة. وقال الطبيب الشرعي المدربين تدريبا عاليا ديه لتقييم ذاتي بصريا بنية الأنسجة والتشكل الخلوي لتحديد التشخيص. نحن هنا تظهر كيفية جمع الصور IR عالية الدقة من نفس النوع من أقسام ومناقشة بعض النهج الحسابية لدراسة الاختلافات الكيميائية بين أنواع الخلايا والحالات المرضية.
الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي للتأكد من أن الأنسجة التي تركز بعناية فائقة وأن النظام معايرة بشكل جيد لضمان البيانات الطيفية ذات جودة عالية جدا. الرعاية عند إعداد هذا النظام هو criti ولا سيما كال عند العمل مع أهداف التكبير عالية. للمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها، القائمة التالية تغطي بعض الصعوبات المحتملة التي تمت مواجهتها؛
مشكلة: انخفاض كثافة الأشعة تحت الحمراء عند التصوير في التفكير. الحل: تحقق IR التوجه الشريحة مثل طلاء عاكسة قد تكون على الجانب الخطأ من الشريحة.
مشكلة: انخفاض إشارة / علامة تحذير الأحمر في مراقبة لانسر. الحل: كشف كول مع LN2. مطلوب النيتروجين السائل للكشف عن FPA على العمل ويتطلب دوريا يجري تصدرت تصل.
المشكلة: سرعة الأخطاء الخطأ / الحركة. الحل: إعادة تعيين مطياف وتقليل الاهتزازات. سوف تسبب الاهتزازات المرآة تتحرك في تداخل أن بالانزعاج.
المشكلة: ارتفاع بخار الماء في البيانات. الحل: زيادة تطهير على النظام وحماية عينة من الهواء.
المشكلة: centerburst غير صالح. الحل: البحث centerburst مرة أخرى.
e_content "> المشكلة: الفرق انخفاض تدفق في نقل، على الرغم من تركز الحل: ضبط المكثف أسفل هذا سوف يحدث كما هو لا يجري التركيز ضوء الأشعة تحت الحمراء إلى نقطة على العينة.في هذه الورقة، فقد ركزنا على كيفية الحصول على صور عالية الوضوح IR من الأنسجة في أي انتقال أو وضع transflectance. طبيعة التصوير FT-IR، هو أن هناك تعديلات المتعددة التي يمكن إدخالها على الحصول على البيانات، مثل، نوع من الركيزة، تقنية التثبيت، سمك العينة، القرار الطيفي، وتداخل سرعة مرآة الخ تأثير هذه المعلمات لديها نوقشت بالتفصيل واسعة في الآونة الأخيرة 4،5،17،51.
وهناك عدد من التعديلات التي يمكن إدخالها على نظام التصوير بما في ذلك التصوير في وضع ATR 10،24،26 وباستخدام نهج الحرارية النانوية 52،53 للسماح لارتفاع القرار التصوير IR. القيد الرئيسي مع ارتفاع القرار التصوير IR هو أن منظمة الشفافية الدوليةssues يجب أن يكون مستعدا بعناية ورقيقة بما يكفي لIR لتمرير من خلال (عادة 4 سمك ميكرون). وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب نقل والانعكاس FT-IR التصوير العينات إلى أن تكون جافة بسبب امتصاص الأشعة تحت الحمراء عن طريق المياه. ومع ذلك، FT-IR التصوير ديه مزايا هامة على تقنيات أخرى، في أن ما في وسعها صورة بسرعة جدا مساحات واسعة من الأنسجة في حين اشتقاق المعلومات الكيميائية الحيوية الغنية وتفصيلا. وتشمل التقنيات الأخرى المماثلة التي تستمد المعلومات الحيوية بطريقة خالية من التسمية رامان الطيفي، ولكن وقت الحصول على البيانات أبطأ بكثير للحصول على الصور. النهج الجديد التصوير رامان آخذة في الظهور بما في ذلك محفز رامان نثر (SRS) ومتماسك Antistokes رامان نثر (CARS)؛ ومع ذلك، لديهم مجموعة وصول الطيفية محدود أو التصوير تيرة واحدة.
قد يكون تقدما في سرعة الحصول على البيانات، التحليل المكاني، وتوافر النهج الحسابية من قيمة كبيرة في جعل FT-IR ايماج جي نهجا أكثر جدوى للترجمة كأداة التصوير الجديدة في علم الأمراض. وكانت التطورات الأخيرة في القرار المكانية أهمية خاصة بالنسبة للأمراض الأنسجة نتيجة لأنواع الخلايا الأساسية لا يجري للحل باستخدام نظم التصوير FT-IR التقليدية. الورقة الأخيرة التي ريدي وآخرون. أظهرت كيفية تصميم نموذج نظام مثالي للحصول على قرار المكاني الأمثل لنظام التصوير FT-IR 5. على سبيل المثال أنسجة الكلى المقدمة في هذه الورقة يوضح أهمية القرارات المكانية أعلى من أجل استخراج المعلومات الحيوية من الهياكل الكبيبي (الشكل 3) والشكل (5). في المستقبل، التطورات الجديدة في الكم تتالي الليزر كما مشرقة جدا مصادر الضوء الأشعة تحت الحمراء 54-57، 3D الطيفي التصوير 58، وتحقيق اختراقات في مجال تقنيات النانو IR 52،53،59،60 عقد آفاقا جديدة مثيرة من البحوث التي قد يكون لها آثار ضخمة في مستقبل التصوير الأنسجة.
<p clالحمار = "jove_content"> لقد قدمنا أمثلة من التطبيقات في الكبد وأمراض الكلى حيث أن هناك حاجة للحصول على معلومات إضافية الكيميائية الحيوية التي يمكن أن تكون ذات قيمة تشخيصية. ويركز مختبر علم الأمراض الطيفي في قسم علم الأمراض في جامعة إلينوي في شيكاغو على ترجمة تقنيات التصوير IR نحو تحسين تشخيص الأمراض وتحسين التنبؤ بنتائج المرضى. قد التصوير FT-IR التغلب على بعض القيود الحالية في ممارسة علم الأمراض التي تتطلب معلومات كمية وموضوعية. على وجه الخصوص، ويتركز العمل في المستقبل على تحديد المناطق في ممارسة علم الأمراض الحالية حيث تفشل التقنيات الحالية لتوفير الحساسية التشخيصية المناسبة أو تقديم معلومات محدودة. وثمة حاجة واضحة في تحسين الممارسة الحالية للعلم الأمراض ونحو إعطاء المزيد من المعلومات إلى الطبيب الشرعي حول حالة مرض المريض، والتي قد تكون قابلة للتحقيق باستخدام عالية الوضوح التصوير FT-IR.The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |