Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza

Un gran numero di proteine ​​di mammifero sono fortemente modificato dall'azione di enzimi seguito della biosintesi delle proteine ​​del ribosoma. Queste modificazioni post-traduzionali (PTM) possono aumentare notevolmente la diversità funzionale del proteoma modificando le dimensioni, la carica, la struttura, e lo stato di oligomerizzazione (tra le altre caratteristiche) di proteine ^​​1-3. Di conseguenza, il cambiamento della struttura di proteine ​​può portare a conseguenze fisiologiche, quali la degradazione delle proteine, differenziazione cellulare, segnalazione, la modulazione dell'espressione genica, e le interazioni proteina-proteina. Mentre queste modificazioni sono prevalenti in una grande percentuale di tutte le proteine ​​umane, il terminale termina il istoni subiscono un numero insolitamente elevato di modificazioni covalenti ^4. Istoni sono una famiglia di proteine ​​strutturali che facilitano la condensazione del DNA genomico. Covalenti modificazioni delle code istoniche non strutturati sono effettuate e regolate da una series di enzimi in grado di catalizzare la modifica covalente di residui (scrittori), invertire le stesse modifiche (gomme), e distinguere tra i cambiamenti che sono impresse sulle code degli istoni (lettori) ^5-7. In realtà, la maggior parte dei PTM conosciute si possono osservare in questo breve segmento del istoni compresi metilazione, fosforilazione, acetilazione, sumoilazione, ubiquitinazione e citrullination ^8.

Citrullination comporta la conversione del peptidil-arginina al t RNA non codificato peptidil-citrullina (Figura 1A). Le proteine, responsabili di questa catena di neutralizzazione lato, sono membri del PAD (p eptide un rginine eiminase d) famiglia di proteine, che sono tutti enzimi calcio-dipendenti. ^9,10. Fino ad oggi, cinque membri della famiglia PAD sono state descritte (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, e PAD6). Ogni membro di questa famiglia sembra indirizzare proteine ​​cellulari distinti e anche visualizza unique profili distribuzione tissutale. PAD4 è l'unico membro di questa famiglia di proteine ​​note per essere localizzato all'interno del nucleo tramite una sequenza di localizzazione nucleare ^11. Pertanto, è stato dimostrato per deiminate un numero di bersagli nucleari, comprese le catene laterali di arginina sulle code N-terminali degli istoni H2A residuo di arginina (3 H2R3), H3 (H3R2, H3R17 e H3R26) e H4 (H4R3) ^{12, 13.} Mentre ciascuna delle isoenzimi PAD hanno funzioni fisiologiche specifiche e critiche, PAD4 ha ricevuto molta più attenzione a causa del suo ruolo in una serie di processi umani in cellule di entrambi i malati e sani. Recentemente, PAD4 ha dimostrato di essere un membro della pluripotenza trascrizionale di rete ^14. Entrambi i livelli di espressione PAD4 e l'attività hanno dimostrato di essere elevata durante la riprogrammazione e la terra statali stati pluripotenti nei topi. Controllando la regolazione dei geni di cellule staminali, PAD4 può mantenere un ruolo centrale nella riprogrammazione cellulare efficienza. PAD4 è stato anche coinvolto nelformazione di trappole extracellulari dei neutrofili, che dopo il legame di agenti patogeni consentire loro liquidazione sistema. La hypercitrullination di proteine ​​istoniche da PAD4 induce decondensazione della cromatina, che serve come materiale di base per l'incapsulamento di batteri patogeni da parte della trappola extracellulare, in modo da scongiurare infezioni batteriche ^15,16.

Inoltre, PAD4 è stata trovata a svolgere un ruolo attivo in una serie di malattie umane. È stato precedentemente dimostrato che l'espressione aberrante di PAD4 è associato con l'insorgenza e la gravità di artrite reumatoide, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, sclerosi multipla e ^17. Infatti, la presenza di anticorpi anti-proteina citrullinati è uno dei biomarcatori diagnostici e prognostici più affidabili e definitive di artrite reumatoide ^18. Analogamente, l'attività PAD4 disregolazione stato recentemente osservato in un certo numero di tumori umani inclusi dell'ovaio, della mammella, del polmone, und tumori esofagei ^19-22. Il legame tra PAD4 e il cancro ha dimostrato di essere mediata attraverso l'oncogene ELK1 o tramite il tumore soppressore p53 proteina ^22,23 e lavoro precedente ha suggerito che PAD4 potrebbe essere un anti-cancro nuovo bersaglio terapeutico ^17,24,25. Come una prova di principio studio, l'esaurimento delle PAD4 via shRNA nella linea cellulare del cancro del colon-retto HCT116 si è rivelato essere sufficiente per indurre l'apoptosi e arresto del ciclo cellulare ^26. Un inibitore irreversibile PAD4 recentemente sviluppato ha portato ad una riduzione del settanta per cento della massa tumorale nei topi ^27. Piuttosto notevole, l'inibizione PAD4 sembrava operare come una terapia mirata che ha provocato l'uccisione selettiva delle cellule cancerose risparmiando cellule non trasformate.

L'uso di piccole molecole per disattivare la funzione di PAD4 può rivelarsi una potente strategia nuova per colpire le cellule tumorali o di aumentare chemioterapici cancro esistenti ^28. Purtroppo, un potenda inibitore reversibile PAD4 deve ancora essere scoperto. Un certo numero di inibitori covalenti sono stati sviluppati utilizzando il / maniglia imidine fluoro cloro che imita il substrato arginina ^27,29,30 e hanno dimostrato di essere strumenti pratici per comprendere il ruolo di PAD4 in entrambe le cellule statali sani e malati. Tuttavia, queste molecole inibiscono tutte le pastiglie attivi con potenza simile. Pertanto, la necessità di un saggio superficiale che segnala l'attività di PAD4 è cruciale. Fino ad oggi, PAD4 saggi sono stati descritti che collegano il rilascio di ammoniaca dalla reazione a una lettura colorimetrica ^31, utilizzare un analogo substrato chloroamidine fluorescente per fluorescenza polarizzata test ^32, si basano sulla reazione acida assistita tra gliossale e citrullina ^33, e coppia l'attività PAD4 ad una fluorescenza dequenching passo ^34. Di questi, solo il modificatore strategia haloacetamidine covalente ha dimostrato di essere compatibile con scre elevato throughputpiattaforme zare ^32,35,36. Descriviamo un test basato sulla fluorescenza facile che misura in modo affidabile l'attività di PAD4. Il test, che mostra un forte rapporto segnale-rumore, velocità di analisi, e la robustezza della misura, ha il potenziale per scoprire un inibitore PAD4 veramente potente e selettivo.