PAD4活动通过亲荧光底物类似物基于荧光监测

大量的哺乳动物蛋白质都很大程度上受到酶的下列蛋白质的核糖体的生物合成中的作用进行修改。这些翻译后修饰（翻译后修饰），可以通过改变蛋白^1-3的大小，电荷，结构，和低聚状态（除其他特征），大大提高了蛋白质的功能多样性。其结果是，在蛋白质结构中的改变可以导致生理后果，如蛋白降解，细胞分化，信号传导，调节基因表达，和蛋白质 – 蛋白质相互作用。而这些修改都是在所有人类蛋白质所占的比例很大普及，终端结束对组蛋白进行非常多的共价修饰^4。组蛋白是一族结构蛋白，以促进基因组DNA的缩合的。非结构化组蛋白尾巴的共价修饰都进行了规范，并通过意甲酶可以催化残基（刻录机）的共价修饰，反向相同的修改（橡皮擦），以及其中的变化区分号被印记到组蛋白尾部（读卡器^）5-7。事实上，大多数已知的翻译后修饰可以在组蛋白包括甲基化，磷酸化，乙酰化，SUMO化，泛素化，和瓜氨酸化⁸的这个短段内被观察到。

瓜氨酸化涉及肽基精氨酸转化成非吨的RNA编码的肽基-瓜氨酸（ 图1A）。的蛋白质，负责该侧链中和，是PAD的成员（对eptide 一个rginineðeiminase）蛋白家族，所有这些都是钙依赖性酶^。9,10。到今天为止，PAD家庭的五名成员已被描述（PAD1，PAD2，PAD3，PAD4和PAD6）。这个家庭的每个成员似乎针对不同的细胞蛋白质，并显示单阙组织分布概况。 PAD4是该蛋白家族已知细胞核内通过一个核定位序列¹¹的局部的唯一成员。因此，它已被证明deiminate若干核目标，包括对组蛋白H2A的精氨酸残基3的N末端 ​​尾部精氨酸侧链（H2R3），H3（H3R2，H3R17和H3R26）和^{H4（H4R3）12 13。}而每个PAD同功酶具有特异性和一些重要的生理功能，PAD4已经获得相当多的关注，因为它在一个数均患病和健康细胞的人性化过程的作用。最近，PAD4被证明是多能性的转录网络¹⁴中的一员。既PAD4表达水平和活性示期间小鼠重编程和基态的多潜能状态升高。通过控制干细胞的基因的调节，PAD4可保留在细胞的重编程效率的关键作用。 PAD4也被牵连在形成中性粒细胞胞外的陷阱，对病原体结合后，使他们的系统过关。组蛋白通过PAD4的hypercitrullination诱导染色质，其作为用于病原性细菌的胞外陷阱的封装基体材料的解聚，从而抵挡细菌感染^15,16。

此外，PAD4已经发现了一些人类疾病方面发挥积极作用。先前已证明，PAD4的异常表达与类风湿性关节炎的发病和严重程度相关联，阿尔茨海默氏症，帕金森氏病和多发性硬化^17。事实上，抗瓜氨酸化蛋白的抗体的存在是类风湿性关节炎¹⁸的最可靠的和明确的诊断和预后标志物之 ​​一。同样的，失调的PAD4的活性最近已经在许多人类癌症中，包括卵巢癌，乳腺癌，肺癌，被观察ð食管癌^19-22。 PAD4和癌症之间的联系已经显示出通过ELK1癌基因或经由p53肿瘤抑制蛋白^22,23介导的和以前的工作已经表明，PAD4可能是一个新的抗癌治疗靶^17,24,25。原则研究证明，PAD4通过的shRNA在结肠癌细胞株HCT116枯竭显露足以诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞^26。最近发展不可逆转的PAD4抑制剂导致肿块的小鼠²⁷减少70％左右。很明显，PAD4抑制似乎充当靶向治疗，导致选择性杀伤癌细胞的同时保留未转化的细胞。

使用小分子来关闭PAD4的功能可能被证明是一个强大的新策略，以靶向癌细胞或以增加现有的癌症化学治疗剂^28。不幸的是，一个PO10吨可逆PAD4抑制剂尚未被发现。使用氯/氟imidine手柄模仿精氨酸基板^27,29,30和已被证明是实用的工具，理解健康和患病状态的细胞PAD4的作用已经开发了一些共价抑制剂。但是，这些分子抑制它们都具有类似功效的活性垫。因此，需要有一种简便的测定上PAD4的活性，报告是至关重要的。迄今为止，PAD4测定法已描述了从反应的比色读出³¹连结氨的释放，利用荧光标记的chloroamidine底物类似物为荧光偏振测定法^32，依靠乙二醛和瓜氨酸³³之间的酸-促进反应，并夫妇PAD4活性荧光脱猝灭步骤^34。其中，只有共价修饰haloacetamidine策​​略已被证明是与高通量SCRE兼容效果图创作平台^32,35,36。我们描述一个浅显的基于荧光检测的可靠测量PAD4的活性。该测定法中，其显示很强的信号 – 噪声比，分析速度，和测量的鲁棒性，具有以发现真正有效的和选择性PAD4抑制剂的潜力。