Summary

Выделение и количественный Иммуноцитохимическая Характеристика первичных Миогенные клеток и фибробластов из человеческих скелетных мышц

Published: January 12, 2015
doi:

Summary

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Abstract

Ремонт и восстановление скелетных мышц требуется действие сателлитных клеток, которые являются резидентом мышечные стволовые клетки. Они могут быть выделены из образцов биопсии мышц человек с использованием ферментативного расщепления и их миогенными свойств исследуемых в культуре. Количественно два основных прилипшие типы клеток, полученные из ферментативного пищеварения: (я) сателлитные клетки (называемые миогенные клетки или клетки предшественников мышечных волокон), которые были определены первоначально как CD56 +, а позже CD56 + / Desmin + клеток и (II) мышечно- полученные фибробласты, идентифицированные как CD56 и TE-7 +. Фибробласты пролиферируют очень эффективно в культуре и в группах смешанных клеток эти клетки могут захватить миогенные клетки доминируют в культуре. Выделение и очистка из различных типов клеток из человеческой мышцы, таким образом, важным фактором методической при попытке исследовать врожденной поведение любой тип клеток в культуре. Здесь мы DESCRМБП систему сортировки, основанный на пологом ферментативного переваривания клеток с использованием коллагеназы и диспазу затем магнитного сортировка клеток (MACS), которая дает как высокую чистоту (> 95% миогенные клетки) и хороший урожай (~ 2,8 х 10 6 ± 8,87 х 10 5 клеток / г ткани после 7 дней в пробирке) для экспериментов в области культуры. Этот подход основан на инкубации смешанный мышц, полученных клеточной популяции с магнитных шариков микрошариков, конъюгированных с антителом против CD56, а затем прохождение клетки, хотя в магнитном поле. CD56 + клетки, связанные с микрошариков, сохраняются в области, тогда как CD56 клетки проходят беспрепятственно через колонку. Клеточные суспензии из любой стадии процесса сортировки может быть высевали и культивировали. После данного вмешательства, морфологию клеток и экспрессию и локализацию белков, включая ядерные транскрипционные факторы могут быть количественно, используя Иммунофлуоресцентной маркировки специфическими антителами и изображение рrocessing и анализ пакета.

Introduction

Ремонт и восстановление скелетных мышц требуется действие спутниковых клеток 1, миогенные стволовых клеток 2,3. В естественных условиях эти клетки существуют в состоянии покоя обратимо, расположенной между сарколеммы и базальной пластинки каждого myofibre, но активируются к пролиферации, предохранитель и дифференцировать как мышечная ткань повреждена, ремонт и регенерируется 3. Спутниковые клетки могут быть выделены из молодых и пожилых человек мышечных биоптатов с использованием ферментативного расщепления 4 и их миогенными свойств может затем быть изучены в первичной культуре 5. Эффективность этого процесса изоляции в отношении как выхода и чистоты популяции клеток зависит от используемых методов и может меняться от образца к образцу. Два основных прилипшие типы клеток, полученные из ферментативного расщепления являются клетки-сателлиты (в настоящее время называются миогенные клетки или клетки предшественников мышечных волокон), которые были определены первоначально как CD56 + / Desmin клеток и муSCLE полученных фибробласты, идентифицированные как CD56 и TE7 + клеток 5. Фибробласты имеют быстрый темп пролиферации и не подвергаются необратимому остановку роста и терминальной дифференцировки на межклеточных контактов как миогенных клеток; Таким образом, в смешанных популяциях, фибробласты могут захватить миогенные клетки доминируют в культуре.

Фибробласты часто рассматривается как раздражение для мышц биологов, однако, в настоящее время растет интерес к фибробластов клетки, достойных изучения в их собственном праве, в частности, как они были показаны иметь кооперативную роль миогенных клеток во время мышечной ремонта 6 , Выделение и очистка из различных типов клеток из человеческой мышцы, таким образом, важным фактором методической при попытке исследовать врожденной поведение обоих типов клеток в культуре. Флуоресценции активированных сортировки клеток (FACS) представляет собой способ, при котором клетки могут быть отсортированы для дальнейшего изучения и / или подсчитывали ианализируются. FACS, как было показано, чтобы надежно обогатить миогенные клетки человека, но выход клеток для последующей культуры до сих пор не была высокой 7. Учитывая ограниченный потенциал репликации соматических клеток, таких как сателлитных клеток, полученных из миогенных клеток и очень плохом пролиферации и дифференцировки, связанных со старением 4, более нежные подходы. Холост культуры мышечных волокон предложить другой, менее агрессивны, средства получения мышиных клетки-сателлиты по-прежнему проживают в их sublaminal нише и после их активации в культуре 8,9. Тем не менее, это часто не представляется возможным из человеческой мышечной биопсии материала (из-за волокна редко могут быть получены из сухожилия к сухожилия), что означает, что этот метод не может быть доступным для многих исследовательских лабораторий, заинтересованных в изучении мышечных клеток, полученных человека. Кроме того, единая методика только волокна обеспечивает очень ограниченное число клеток.

Здесь мы опишем систему сортировки, основанный на генTLE ферментативное расщепление клеток с использованием коллагеназы и диспазу в сопровождении двух последовательных раундов магнитного активированного сортировки клеток (MACS), которая дает как высокую чистоту (> 95% миогенные клетки) и выход (~ 2,8 х 10 6 ± 8,87 х 10 5 клеток / г ткани) для экспериментов в области культуры. CD56 считается золотым стандартом поверхностным маркером для идентификации клеток-сателлитов человека в месте 10 и в пробирке 11 и обеспечивает идеальный кандидат поверхностный маркер для крепления борта. При таком подходе CD56 антитела, конъюгированного с оксидом железа и полисахарида, содержащего суперпарамагнитные шарики связаны с клетками и пропускают через высокий градиент магнитного разделительной колонны клеток, помещенной в сильном магнитном поле 12,13. В разделительные колонны заполнены с матрицей ферромагнитных стали шерсти или железа сферах, которые служат, чтобы сосредоточиться силовых линий магнитного поля к их поверхности, генерирующих сильные градиенты магнитного поля (~ 4tesla) 14, В этих колонн даже несколько магнитных клетки притягиваются и адсорбируют на своей поверхности 14. Unbound (CD56 -) клетки проходят через колонку, тогда как CD56 + клетки, помеченные магнитных микросфер, сохраняются до удаления от магнитного поля 12,15.

Клеточные суспензии из любой стадии процесса сортировки можно покрыть при желаемой плотности для дальнейших экспериментов. После данного вмешательства клеточные компоненты могут быть определены с помощью иммуноцитохимии, отображаемого использованием широкого поля или конфокальной флуоресцентной микроскопии и количественный анализ с использованием подхода, анализа изображений, что позволяет быстро объективное измерение всех меченых клеток в той или иной образ. В нашей лаборатории мы использовали этот двоякий подход иммуномагнитный сортировки с последующим анализом изображений 16, чтобы продемонстрировать, что CD56 фибробласты человека легко трансформироваться в адипоциты, в то время как миогенной клеткис спутниковой происхождения обладают высокой устойчивостью к этой адипогенной преобразования 5.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследований, проведенных в нашей лаборатории все субъекты дали письменное информированное согласие на участие и все эксперименты были проведены с одобрения Национального комитета по этике Health Service UK (Комитет Лондоне этике исследований; ссылка: 10 / H0718 / 10) и в соответств…

Representative Results

Очищенные миогенные клетки и фибробласты могут культивироваться в адипогенной дифференциации среды в течение трех дней, после чего адипогенной питательной среде из любой точки между 7-30 дней, чтобы оценить их потенциал для адипогенеза. Используя населения очищенные клетки, Нефть Red O о…

Discussion

Мы описали immunomagentic сортировки процедуру для селективного обогащения прекурсоров человеческие мышечные, полученных от небольших образцов биопсии мышц материала. Эта техника была неоценима в нашей лаборатории для преодоления потерь культур человеческие мышечные, полученных с фиброб?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.

Materials

Collagenase  D Roche  11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 micron cell strainer BD Biosciences 352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) Sigma, Dorset, UK C8919 
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) Sartorius 17573ACK Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads Miltenyi Biotech 130-050-401 Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human Miltenyi Biotech 130-050-601
40 μm Pre-separation filters Miltenyi Biotech 130-041-407
Large Cell Collumns Miltenyi Biotech 130-042-202 These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns  Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMacs Seperator Miltenyi Biotech 130-042-102 This separator fits the large cell column but not the LS column. 
MidiMACS Miltenyi Biotech  130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Must be filter sterilized before use
Oil Red O Sigma O0625
Triethyl phosphate Sigma 538728
Whatman Paper Sigma Z241121-1PAK No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. 
ProLong Gold Antifade Reagent Molecular Probes, Invitrogen P36930 This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision Carl Zeiss Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (purchased from Pugh Computers) ADPH16982* 

Referencias

  1. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
  2. Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
  3. Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
  4. Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
  5. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
  6. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
  7. Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
  8. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
  9. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  10. Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
  11. Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
  12. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
  13. Clarke, C., Davies, S., Brooks, S. A., Schumacher, U. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. 58, 17-23 (2001).
  14. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  15. Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
  16. Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
  17. Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z., DiMario, J. X. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. 798, 21-52 (2012).
  18. Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
  19. Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
  20. Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
  21. Timpl, R., Kvonder Mark, . Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
  22. Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
  23. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
  24. Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
  25. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
  26. Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
  27. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  28. Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
  29. Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
  30. Brown, C. M. Fluorescence microscopy – avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
  31. Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
  32. Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
  33. Fukada, S. -. i., et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
  34. Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).

Play Video

Citar este artículo
Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. R. Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (95), e52049, doi:10.3791/52049 (2015).

View Video