Summary

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Published: January 12, 2015
doi:

Summary

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Abstract

A reparação e regeneração do músculo esquelético requer a acção de células satélites, que são as células estaminais musculares residente. Estes podem ser isolados a partir de amostras de biópsia do músculo humano, utilizando a digestão enzimática e as suas propriedades miog�icas estudadas em cultura. Quantitativamente, os dois tipos principais de células aderentes obtidas a partir da digestão enzimática são: (i) as células satélites (denominados células miogénicas ou células precursoras do músculo), inicialmente identificadas como CD56 + e mais tarde como células CD56 + / + e desmina (ii) músculo- fibroblastos derivados, identificadas como CD56 e TE-7 +. Os fibroblastos proliferam de forma muito eficiente na cultura e nas populações de células mistas essas células podem invadir células miogênicas para dominar a cultura. O isolamento e purificação de diferentes tipos de células de músculo humano é, portanto, um aspecto metodológico importante quando se pretende investigar o comportamento inato de qualquer um dos tipos de células em cultura. Aqui nós descrIBE um sistema de triagem baseada na digestão enzimática suave de células utilizando colagenase e dispase seguido por triagem de células activadas magnético (MACS), que dá um alto grau de pureza (> 95% de células miogénicas) e um bom rendimento (2,8 x 10 ~ 6 ± 8,87 5 x 10 células / g de tecido depois de 7 dias in vitro) para experiências em cultura. Esta abordagem baseia-se na incubação da população mista de células derivadas do músculo com microesferas contas magnéticas conjugadas com um anticorpo contra CD56 e, em seguida, passando células embora um campo magnético. As células CD56 + ligadas a microesferas são mantidas pelo campo enquanto que CD56 células transitar livremente através da coluna. As suspensões de células a partir de qualquer fase do processo de triagem pode ser plaqueada e cultivadas. Após um determinado intervenção, morfologia celular, e a expressão e localização de proteínas, incluindo os factores de transcrição nuclear pode ser quantificada utilizando rotulagem de imunofluorescência com anticorpos específicos e uma imagem pRATAMENTO e pacote de análise.

Introduction

A reparação e regeneração do músculo esquelético requer a acção de células satélites 1, as células estaminais miog�icas 2,3. In vivo, estas células existir num estado quiescente reversivelmente localizado entre o sarcolema e lâmina basal de cada myofibre, mas tornar-se activado para proliferar, fusível e diferenciar como o tecido muscular danificado, reparado e regenerado 3. Células satélite pode ser isolado a partir de amostras de biópsia jovens e idosos músculo humano utilizando digestão enzimática 4 e suas propriedades pode ser subsequentemente miog�icas estudado em cultura primária 5. A eficiência deste processo de isolamento em conta tanto o rendimento e a pureza da população celular depende dos métodos utilizados e podem variar de amostra para amostra. Os dois tipos principais de células aderentes obtidas a partir da digestão enzimática são as células satélites (células miogénicas agora denominadas células precursoras ou músculo), inicialmente identificadas como células CD56 + / desmina, e mufibroblastos derivados de LECSA, identificadas como CD56 e TE7 + 5 células. Os fibroblastos têm uma taxa de proliferação rápida e não sejam submetidos a parada do crescimento irreversível e diferenciação terminal em cima do contato célula-célula, como as células miogênicas; assim, em populações mistas, os fibroblastos podem invadida células miogênicas a dominar a cultura.

Os fibroblastos têm sido muitas vezes visto como uma irritação para os biólogos musculares, no entanto, agora há um interesse crescente em fibroblastos como células dignos de estudo em seu próprio direito, nomeadamente no que eles foram mostrados para ter um papel de cooperação com células miogênicas durante a reparação muscular 6 . O isolamento e purificação de diferentes tipos de células de músculo humano é, portanto, um aspecto metodológico importante quando se pretende investigar o comportamento inato de ambos os tipos de células em cultura. Activada por fluorescência de células (FACS) é um método pelo qual as células podem ser classificadas para estudo adicional e / ou contados eanalisado. FACS tem sido demonstrado de forma fiável para enriquecer células miogénicas humanos, mas o rendimento de células para cultura posterior, até agora não tem tido grande 7. Dado o potencial de replicação limitado de células somáticas, tais como células derivadas de células-satélite Miogênicos e os muito pobres proliferação e diferenciação associados à senescência 4, abordagens mais suaves são obrigatórios. Culturas de fibras musculares individuais oferecem uma outra, menos agressivo, os meios de obtenção de células satélites murino ainda residente em seu nicho sublaminal e após a sua ativação em cultura 8,9. No entanto, isso muitas vezes não é possível a partir de material da biópsia do músculo humano (porque as fibras raramente pode ser obtido a partir de tendão para tendão) o que significa que esta técnica pode não ser acessível a muitos laboratórios de pesquisa interessados ​​em estudar as células derivadas de músculos humanos. Além disso, a técnica de uma única fibra apenas fornece o número de células muito limitadas.

Aqui nós descrevemos um sistema de triagem com base no gendigestão enzimática tle de células utilizando colagenase e dispase seguido por duas rondas sucessivas de triagem de células activadas magnético (MACS), que dá um alto grau de pureza (> 95% de células miogénicas) e rendimento (2,8 x 10 ~ 6 ± 8,87 x 10 5 células / g de tecido) para experimentos em cultura. CD56 é considerado o marcador de superfície padrão de ouro para a identificação de células satélites humanos in situ e in vitro 10 11 e proporciona o marcador de superfície candidato ideal para a fixação do grânulo. Nesta abordagem, os anticorpos CD56 conjugado com óxido de ferro superparamagnético e grânulos contendo polissacáridos estão ligados às células e passado através de uma coluna de separação de células magnético de gradiente elevado colocada num campo magnético forte 12,13. As colunas de separação são cheios com uma matriz de lã de aço ou de ferro ferromagnéticos esferas que servem para concentrar as linhas de campo magnético para a sua superfície gerar fortes gradientes de campo magnético (~ 4tesla) 14. Nestas colunas mesmo células ligeiramente magnéticas são atraídas e adsorvido à sua superfície 14. Unbound (CD56 -) células passam através da coluna enquanto que as células CD56 + marcadas com microesferas magnéticas são mantidos até a retirada do campo magnético 12,15.

As suspensões de células a partir de qualquer fase do processo de triagem pode ser plaqueada a uma densidade desejada para posterior experimentação. Após um determinado intervenção os constituintes celulares podem ser identificados usando imunocitoquímica, fotografada usando de campo amplo ou microscopia de fluorescência confocal e analisados ​​quantitativamente usando uma abordagem de análise de imagem que permite a rápida medição objectivo de todas as células marcadas em qualquer imagem. Em nosso laboratório temos usado essa abordagem triagem imunomagn�ica duplo seguido por análise de imagem 16 para demonstrar que CD56 fibroblastos humanos prontamente transdiferenciam em adipócitos, enquanto célula miogênicas de origem satélite são altamente resistentes a esta conversão adipogênica 5.

Protocol

NOTA: Para os estudos realizados em nosso laboratório de todos os indivíduos deram o seu escrito, o consentimento informado para participar e todos os experimentos foram realizados com aprovação do Comitê de Ética Serviço Nacional de Saúde do Reino Unido (Comitê de Ética em Pesquisa Londres; referência: 10 / H0718 / 10) e de acordo com a Human Tissue Act e da Declaração de Helsinki. 1. Preparação inicial antes da biópsia do músculo (15 min) Adicione meio de cresci…

Representative Results

As células miogénicas purificada e fibroblastos podem ser cultivadas em meio de diferenciação adipogênica durante três dias, seguidos de meio de nutrição adipogénica de qualquer lugar entre 7-30 dias, para avaliar o seu potencial para a adipogénese. Usando as populações de células purificadas, Oil Red O coloração em combinação com a imunomarcação para marcadores de linhagem adipog�icas e miog�icas mostrou que apenas a fracção de fibroblastos era capaz de diferenciação de adipócitos <str…

Discussion

Nós descrevemos um procedimento de triagem immunomagentic para o enriquecimento selectivo de precursores derivadas de músculos humanos a partir de pequenas amostras de material de biópsia do músculo. Esta técnica tem sido valiosa no nosso laboratório para superar a perda de culturas derivadas de músculos humanos para fibroblastos, mas também para a compreensão do comportamento exclusivo das populações distintas de células progenitoras derivadas de músculos. Uma vez que as células miogénicas purificados po…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.

Materials

Collagenase  D Roche  11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 micron cell strainer BD Biosciences 352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) Sigma, Dorset, UK C8919 
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) Sartorius 17573ACK Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads Miltenyi Biotech 130-050-401 Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human Miltenyi Biotech 130-050-601
40 μm Pre-separation filters Miltenyi Biotech 130-041-407
Large Cell Collumns Miltenyi Biotech 130-042-202 These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns  Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMacs Seperator Miltenyi Biotech 130-042-102 This separator fits the large cell column but not the LS column. 
MidiMACS Miltenyi Biotech  130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Must be filter sterilized before use
Oil Red O Sigma O0625
Triethyl phosphate Sigma 538728
Whatman Paper Sigma Z241121-1PAK No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. 
ProLong Gold Antifade Reagent Molecular Probes, Invitrogen P36930 This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision Carl Zeiss Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (purchased from Pugh Computers) ADPH16982* 

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Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. R. Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (95), e52049, doi:10.3791/52049 (2015).

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