La production et l'isolement des axones de neurones sensoriels de l'analyse biochimique Utilisation des filtres poreux
Summary
This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.
Abstract
Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.
Introduction
Le compartiment axonal des neurones montre un grand degré d'indépendance fonctionnelle du compartiment somato-dendritique. Dans les neurones de projection, les axones contiennent la majeure partie de la protéine de 1,2 neuronale. L'étude de la physiologie et la physiopathologie des axones a pris de l'ampleur dans la communauté des neurosciences car des études récentes ont montré que la dysfonction axonale précoce semble être une caractéristique commune des maladies neurodégénératives et des troubles neuropsychiatriques 3. Il semble probable qu'une meilleure compréhension des mécanismes de axonales exclusive dans des conditions normales et pathologiques fera la lumière sur les événements précoces qui conduisent un dysfonctionnement.
Le présent protocole décrit comment utiliser les inserts de culture portant une membrane poreuse (filtre) pour obtenir de grandes quantités de matériau pur axonale qui est approprié pour l'analyse biochimique et immunocytochimique. L'utilisation de cartouches filtrantes pour étudier la biologie axonale a été mis en œuvre par Steward et4 collègues et d'autres développés par Twiss et ses collègues 5 à sa configuration actuelle. La technique est maintenant en cours d'utilisation par des groupes qui étudient différents aspects de axonale et dendritique biologie, avec de légères modifications dans chaque cas à accueillir pour la population de neurones étudiés, les traitements effectués et le type d'analyses biochimiques utilisés 6-9. Le présent protocole n'a pas l'intention d'accueillir toutes les alternatives pour une telle variété d'applications, mais plutôt de fournir une approche simple qui convient à la plupart des applications. En particulier, le protocole décrit ici utilise un revêtement triple qui maximise le rendement des axones pour les analyses biochimiques et est le plus approprié pour étudier axonales revêtements de dégénérescence-autres décrits dans la littérature produite moins axones qui se rétractent et dégénèrent rapidement en cas de privation de facteurs trophiques 9.
Dans cette procédure, les corps cellulaires neuronaux restent isolés au sommet de la wh de filtreaxones ile passent à travers les pores et se développent le long de sa surface inférieure. Axones purs (gratuite, la glie et les neurones contaminants du corps cellulaire) qui se développent sur la surface inférieure du filtre peuvent être collectés pour des analyses biochimiques ou peuvent être fixés in situ et examinés par des techniques immunocytochimiques 9. Le procédé repose sur l'utilisation de neurones sensoriels embryonnaires du ganglion de la racine dorsale (DRG). DRG embryonnaires sont largement utilisés pour étudier la biologie axonale car neurites de ces cellules subissent une croissance rapide et robuste in vitro lorsqu'il est maintenu dans facteur de croissance nerveuse (NGF), et parce qu'ils subissent rapidement la dégénérescence lorsqu'ils sont privés de ce facteur. En outre, les neurones DRG manquent dendrites, de sorte que tous les neurites recueillies par cette méthode sont purement axones.
inserts de filtre représentent un grand avantage par rapport aux autres approches utilisées pour étudier les axones. Des études reposant sur l'utilisation de la microscopie à différencier les processus se produisant dans le corps cellulaire de celles dans unXons fournissent des informations biochimiques limitée. Comme autre exemple, les systèmes de culture compartimentés (par exemple, les chambres de Campenot 10 ou dispositifs microfluidiques 11) sont utiles pour les approches d'imagerie et de traitement différencié des compartiments cellulaires, mais ne fournissent que des petites quantités de matériel axonal, empêchant l'utilisation de ces techniques pour les analyses biochimiques qui nécessitent des quantités relativement importantes de l'échantillon. En outre, leur utilisation nécessite une formation importante ainsi que des dispositifs spécialisés, et ils prennent beaucoup de temps. Une autre approche souvent utilisée pour isoler les axones à partir d'explants est de supprimer manuellement un centre d'explantation (contenant les corps cellulaires neuronaux) avant la collecte de l'échantillon axonale. Même si cela peut produire de grandes quantités de préparations axonales enrichi, les axones de cette préparation peuvent être enveloppés dans des cellules gliales et éliminer rapidement les corps des 20 explants consécutivement à partir de 6 puits (à titre d'exemple d'une expérience minimum) prend du temps et à la limite de la faisabilité.
En revanche, la méthode présentée ici produit des préparations axonales abondante et pure qui peut être ensuite analysé par pratiquement n'importe quelle technique biochimique qui est couramment utilisé pour analyser les lysats de cellules entières, comme Western blot, immunoprécipitation 6, transfert de Northern 5 par spectrométrie de masse 6, la purification de l'ARN 7,12,13, entre autres. En outre, le protocole peut être appliqué à immunofluorescence (IF) techniques, comme il est possible de fixer les axones en croissance dans le côté inférieur du filtre à examiner plus en détail les IF. Cette approche facilite grandement l'analyse des processus spécifiques axonales car il n'y a pas de corps cellulaires dans la préparation finale. C'est un avantage important car un signal haute immunofluorescence de corps cellulaires mine souvent l'examen et l'analyse d'un signal faible provenant de structures minces tels que des axones.
Deux applications du procédé de culture pour étudier la dégénérescence axonale are décrit; un modèle de taille de développement et un modèle de dégénérescence induite par une lésion (communément appelée dégénérescence comme wallérienne). La modélisation de l'élagage de développement est basé sur le fait que les neurones sensoriels in vivo en concurrence pour des montants de NGF cible dérivé et ceux ne recevant pas assez dégénéré de support neurotrophique 14 limiter. Ce phénomène peut être mimée dans des cultures de DRG embryonnaires par le retrait de NGF à partir du milieu de culture, ce qui, comme cela se passe in vivo, déclenche une dégénérescence axonale suivie de destruction du corps de la cellule. Pour modéliser la dégénérescence wallérienne, la partie supérieure du filtre avec les corps cellulaires est grattée. Les axones qui avaient poussé sur le côté inférieur du filtre séparées physiquement les corps cellulaires et subir par la suite, le processus dégénératif rapide et stéréotypé appelé dégénérescence wallérienne 15, nommé d'après A. Waller qui a le premier signalé le phénomène en 1850 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les paramètres importants à prendre en considération lors de l'adaptation de cette technique comprennent la population neuronale qui sera étudié, le substrat, la taille des pores du filtre et la zone de surface. Tous ces paramètres auront une incidence sur la spécificité, la qualité et la quantité de la préparation des neurites obtenu, et doivent être soigneusement examiné par l'utilisateur final. Dans les exemples présentés dans ce protocole, l'utilisation de neurones DRG a l'avantage d&#…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.
Materials
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon Cell Culture Companion Plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C |
| PureCol Bovine Collagen Solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM. |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF Antibody | Prepared in-house | – | As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991) |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-Tubulin Antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1X Laemmli Sample Buffer | |||
| 10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue |
Referencias
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
