Producción y aislamiento de los axones de las neuronas sensoriales para el análisis bioquímico Usando porosos Filtros
Summary
This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.
Abstract
Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.
Introduction
El compartimiento axonal de las neuronas muestran un alto grado de independencia funcional del compartimiento somato-dendrítica. En las neuronas de proyección, los axones contienen la mayor parte de la proteína de 1,2 neuronal. El estudio de la fisiología y la patofisiología de los axones ha cobrado fuerza en la comunidad de las neurociencias porque los estudios recientes han demostrado que la disfunción axonal temprana parece ser una característica común de las enfermedades neurodegenerativas y trastornos neuropsiquiátricos 3. Parece probable que una mejor comprensión de los mecanismos-axonales exclusiva en condiciones normales y patológicas arrojará luz sobre los primeros eventos que conducen a la disfunción.
El presente protocolo describe cómo utilizar insertos de cultivo que lleva una membrana porosa (filtro) para obtener grandes cantidades de material axonal pura que es adecuado para la bioquímica y análisis inmunocitoquímico. El uso de filtro inserta estudiar biología axonal fue implementado por primera vez por Steward y4 colegas y seguirá trabajando Twiss y sus colegas 5 a su configuración actual. La técnica está ahora en uso actual por grupos que estudian diversos aspectos de la biología axonal y dendrita, con ligeras modificaciones en cada caso para adaptarse a la población de neuronas estudiados, los tratamientos realizados y el tipo de análisis bioquímicos utilizados 6-9. El presente protocolo no tiene intención de dar cabida a todas las alternativas para una variedad de aplicaciones tales, sino más bien proporcionar un enfoque simple que es adecuado para la mayoría de aplicaciones. En particular, el protocolo descrito aquí utiliza un revestimiento de triple que maximiza el rendimiento axonal para los análisis bioquímicos y es más adecuado para estudiar axonales revestimientos-degeneración otra descritos en la literatura producida menos axones que se retraen y degeneran más rápido cuando se le priva de factores tróficos 9.
En este procedimiento, los cuerpos celulares neuronales permanecen aislados en la cima de las qu filtroaxones ile pasan a través de los poros y crecen a lo largo de su superficie inferior. Axones Pure (libres de células gliales y contaminantes del cuerpo celular neuronal) que crecen en la superficie inferior del filtro pueden ser recogidos para análisis bioquímicos o se pueden fijar in situ y se examinaron mediante técnicas inmunocitoquímicas 9. El procedimiento se basa en el uso de las neuronas sensoriales embrionarias a partir de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). GRD embrionarias son ampliamente utilizados para estudiar la biología axonal porque neuritas de estas células experimentan un crecimiento rápido y robusto in vitro cuando se mantiene en factor de crecimiento nervioso (NGF), y porque se someten a la degeneración rápidamente cuando se le priva de este factor. Además, las neuronas DRG carecen de dendritas, de manera que todas las neuritas recogidos por este método son puramente axones.
Elementos filtrantes representan una gran ventaja en comparación con otros métodos utilizados para estudiar los axones. Estudios dependen de la utilización de la microscopía para diferenciar los procesos que ocurren en el soma celular de las de unXons proporcionan información bioquímica limitada. Como otro ejemplo, los sistemas de cultivo compartimentadas (por ejemplo, cámaras Campenot 10 o dispositivos de microfluidos 11) son útiles para los enfoques de formación de imágenes y para el tratamiento diferencial de los compartimentos de la célula, pero proporcionan sólo pequeñas cantidades de material axonal, lo que impide el uso de estas técnicas para los análisis bioquímicos que requieren cantidades relativamente grandes de muestra. Además, su uso requiere una formación importante, así como dispositivos especializados, y son mucho tiempo. Otro enfoque a menudo se utiliza para aislar los axones de explantes es quitar manualmente un centro de explante (que contiene los cuerpos celulares neuronales) antes de la recogida de muestras axonal. Aunque esto puede producir grandes cantidades de preparaciones del axón enriquecido, los axones en esta preparación pueden ser envueltos en glía y eliminar rápidamente los cuerpos 20 de explantes consecutivamente de 6 pozos (como un ejemplo de un experimento mínimo) es que consume tiempo y en el límite de la viabilidad.
En contraste, el método presentado aquí produce preparaciones axonales abundantes y puros que se pueden analizar por prácticamente cualquier técnica bioquímica que se utiliza comúnmente para analizar lisados de células enteras, como western blot, inmunoprecipitación 6, transferencia de Northern 5 espectrometría de masas 6, la purificación del ARN 7,12,13, entre otros. Además, el protocolo se puede aplicar a inmunofluorescencia (IF) técnicas, ya que es posible fijar los axones que crecen en el lado inferior del filtro de examinar más a ellos por SI. Este enfoque facilita en gran medida el análisis de los procesos axonales-específica ya que no hay cuerpos celulares en la preparación final. Esta es una ventaja significativa ya que una señal de alta inmunofluorescencia desde los cuerpos celulares a menudo socava examen y análisis de una señal más débil procedente de estructuras delgadas tales como los axones.
Dos aplicaciones del método de cultivo para estudiar AR degeneración axonalE descrito; un modelo de la poda de desarrollo y un modelo de degeneración inducida por la lesión (comúnmente conocida como degeneración walleriana). El modelado de la poda de desarrollo se basa en el hecho de que las neuronas sensoriales in vivo compiten para limitar cantidades de NGF derivado de la diana y aquellos que no lo suficiente para recibir degenerada apoyo neurotrófico 14. Este fenómeno se puede imitar en cultivos de DRG embrionarias mediante la retirada de NGF del medio de cultivo, que, como sucede in vivo, inicia la degeneración axonal seguida de la destrucción cuerpo de la célula. Para modelar la degeneración walleriana, la parte superior del filtro con los cuerpos celulares se raspa. Los axones que habían crecido en el lado inferior del filtro se separan físicamente de los cuerpos celulares y se someten a partir de entonces el proceso degenerativo rápida y estereotipado conocida como degeneración walleriana 15, el nombre de A. Waller que informó por primera vez el fenómeno en 1850 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los parámetros más importantes a tener en cuenta para la adaptación de esta técnica incluyen la población neuronal que será estudiado, el sustrato, el tamaño de poro del filtro y superficie. Todos estos parámetros tendrán un impacto en la especificidad, la calidad y cantidad de la preparación de las neuritas obtenido, y deben ser cuidadosamente considerados por el usuario final. En los ejemplos presentados en este protocolo, el uso de las neuronas DRG tiene la ventaja de que se extiende sólo los axones, dando…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.
Materials
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon Cell Culture Companion Plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C |
| PureCol Bovine Collagen Solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM. |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF Antibody | Prepared in-house | – | As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991) |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-Tubulin Antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1X Laemmli Sample Buffer | |||
| 10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue |
Referencias
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