The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.
Le poisson zèbre est devenu un modèle vertébré grand public qui est pertinente pour de nombreuses disciplines de l'étude scientifique. Poisson zèbre sont particulièrement bien adaptés pour l'analyse génétique avant des processus de développement en raison de leur fécondation externe, taille embryonnaire, l'ontogenèse rapide, et la clarté optique – une constellation de traits qui permettent l'observation directe des événements allant de la gastrulation à l'organogenèse avec une loupe binoculaire de base. En outre, les embryons de poisson zèbre peuvent survivre plusieurs jours dans l'état haploïde. La production d'embryons haploïdes in vitro est un outil puissant pour l'analyse mutationnelle, car elle permet l'identification des allèles mutants récessifs présents dans la première génération (F1) des femmes porteuses suivantes mutagenèse dans le parental (P) génération. Cette approche élimine la nécessité d'élever plusieurs générations (F2, F3, etc) qui implique la reproduction des familles mutantes, économisant ainsi le temps de chercheur ainsi que la réductionles besoins en espace de poisson zèbre de la colonie, le travail et les coûts d'élevage. Bien que le poisson zèbre ont été utilisés pour mener de l'avant écrans pour les dernières décennies, il ya eu une expansion régulière des transgéniques et génome des outils d'édition. Ces outils offrent maintenant une multitude de façons de créer des analyses nuancées pour les prochaines écrans de nouvelle génération qui peuvent être utilisés pour disséquer les réseaux de régulation des gènes qui conduisent vertébré ontogenèse. Ici, nous décrivons comment préparer embryons de poisson zèbre haploïdes. Ce protocole peut être mis en œuvre pour de nouveaux futurs écrans haploïdes, comme dans les écrans amplificateurs et suppresseurs, pour faire face aux mécanismes de développement pour un large nombre de processus et de tissus qui se forment pendant stades embryonnaires.
Les processus fondamentaux qui orchestrent le développement des vertébrés sont largement conservées 1. Un moyen puissant pour identifier les gènes des rôles essentiels dans le développement est d'isoler des mutations héréditaires qui conduisent à des défauts phénotypiques dans le processus d'intérêt. Le poisson zèbre, Danio rerio, est une petite espèce d'eau douce de poissons téléostéens appartenant à la famille des poissons cyprinidés qui est devenu un organisme modèle largement utilisé pour la génétique du développement des vertébrés au cours des dernières décennies 2. Oeufs fécondés de poisson zèbre à l'extérieur, permettant l'accès à la zygote dès le début de la fertilisation 3. En outre, l'embryon est optiquement transparent, permettant la visualisation de développement avec une loupe binoculaire simple, 3. Ontogenèse poisson zèbre est rapide, avec les processus de clivage, gastrulation, l'organogenèse et de nombreuses structures, comme le cœur et les reins, en grande partie achevés au cours du premier jour de développement 3. Til temps de stades larvaires à la maturité sexuelle prend 2-3 mois, et les adultes sont de petits vertébrés environ 3-4 cm de longueur, de sorte que de nombreux poissons peuvent être maintenus dans un espace minimal 2. En outre, les adultes de poisson zèbre ont une fécondité élevée, avec chaque poisson en mesure de produire plusieurs centaines d'embryons par semaine 2. Ces attributs ont rendu la traçabilité de poisson zèbre pour avant et arrière écrans génétiques. Poisson zèbre possède un degré élevé de conservation dans leur anatomie, biologie cellulaire, physiologie et des espèces de vertébrés les plus avancés comme les mammifères 2,4. En effet, une analyse récente de la séquence a montré que le génome contient des homologues de poisson-zèbre à près de 70% des gènes humains 5. Cette conservation a permis aux chercheurs d'utiliser le poisson zèbre comme modèle pour de nombreuses maladies humaines, y compris à la fois embryonnaire et conditions adultes 2,4. Pris ensemble, ces facteurs ont rendu le poisson-zèbre un excellent système pour les écrans visant à identifier les gènes qui sontessentiel pour l'ontogenèse des vertébrés normale.
Un certain nombre de grands écrans à grande échelle ont été menées chez le poisson zèbre et ont identifié plusieurs milliers de mutations dans les gènes du développement 6-8. Le mâle adulte poisson zèbre se prête à une mutagenèse, et altérations chromosomiques peut être généré avec une fréquence relativement élevée en utilisant le éthylnitrosourée mutagène chimique (FRA) 6,7 ou mutagenèse par insertion rétrovirale 9. À ce jour, plus de 9000 mutations héréditaires ont été créés, et comprendre des gènes qui affectent pratiquement tous les aspects de l'embryogenèse. La communauté poisson zèbre a créé une banque centralisée de ces mutants au Centre international des ressources de poisson zèbre (ou ZIRC) 10, qui a rassemblé environ 5000 allèles mutants et transgéniques dans le monde entier. Beaucoup de ces mutations ont été analysées et cloné, donnant aux chercheurs dans toutes les disciplines biologiques des renseignements précieux qui a été utilisé pour démêler numeroNous voies cellulaires et physiologiques à travers les idées provenant des expériences de poisson zèbre.
Bien que les écrans à terme ont identifié un nombre impressionnant de gènes importants, il reste encore beaucoup à être apprécié sur les réseaux de régulation génétiques qui interviennent dans une multitude de processus. De nombreux écrans menées jusqu'à présent n'ont pas atteint la saturation, et donc de l'avant ainsi que des écrans de génétique inverse sont restés une pierre angulaire d'identifier et d'analyser les mécanismes de l'embryogenèse. Bien qu'il existe des idées extraordinaires qui peuvent être tirées à partir de n'importe quelle ligne mutant poisson zèbre unique, un facteur limitant majeur dans le domaine a toujours été l'effort de temps impliqué dans le clonage positionnel. Pour cette raison, l'identité de nombreuses mutations induites chimiquement est restée un mystère. Cependant, avec l'avènement récent des approches de séquençage du génome entier qui facilitent le clonage rapide 11-14, identification incroyablement efficace des mutations génétiques est maintenant feasible.
L'écran avant prototype dans le poisson zèbre est un écran diploïde qui peut identifier des mutations récessives dans les trois générations 6,7 (figure 1, colonne de gauche). Cette technique consiste à générer des mutations dans les cellules germinales du mâle parentale (P), puis l'accouplement ce mâle avec une femelle de type sauvage. Chacun de la première génération (F1) descendance de ce croisement seront abriter une ou plusieurs mutations uniques en raison des contributions chromosomiques du génome paternel muté. La descendance F1 sont élevés et par croisement avec des types sauvages pour créer des familles de F2. Dans la famille de F2, frères et sœurs seront soit de type sauvage ou les porteurs hétérozygotes, et sont incrossed hasard pour générer embrayages F3 qui sont analysés pour phénotype (s) d'intérêt. Les embrayages F3 de porteurs hétérozygotes contiennent 25% de type sauvage, 50% hétérozygotes et 25% homozygote poisson mutant. Ce schéma de dépistage multi-générationnelle est efficace, cependant un inconvénient majeur à cela uneAPPROCHE comprend le temps nécessaire pour se préparer à l'écran: au moins 1 an d'élevage de poissons est seul en cause, puisque chaque génération a besoin d'environ 3 mois pour atteindre la maturité sexuelle. Autres limites de ce type d'écran diploïdes sont le travail, l'espace, et le coût du logement ces générations.
L'écran est un haploïde alternative qui peut être utilisée pour identifier et isoler la suite des mutations récessives en utilisant des stratégies de mutagenèse similaires 15 (figure 1, colonne de droite). La production d'embryons de poisson zèbre haploïdes a d'abord été décrit il ya plus de 30 ans 16, et la capacité du poisson zèbre normalement diploïde à développer pendant plusieurs jours avec une ploïdie chromosomique haploïde a été utilisé pour de nombreuses études génétiques depuis cette époque. Le principal avantage de l'écran haploïde est que cette méthode ne comporte pas élever une famille F2 afin de dépister les allèles mutants récessifs. Au lieu de cela, les femelles de la génération F1 sont évalués pourhétérozygotie des mutations récessives dans le processus d'intérêt en examinant leur progéniture F2 dans un état haploïde (figure 1, colonne de droite). Dans l'ensemble, les mesures pour se procurer des embryons haploïdes sont relativement simples (figure 2). Après la préparation des solutions nécessaires pour la manipulation de sperme, les oeufs sont obtenus à partir de femelles de la génération F1 par la manipulation manuelle de manière à extruder (ou «squeeze»), les œufs du ventre. Une fois les oeufs sont obtenus, ils sont fertilisés in vitro par exposition à un rayonnement ultraviolet (UV) du sperme inactivé. Le sperme inactivé aux UV sont incapable de contribuer ADN viable pour l'œuf en raison du fait que la longueur d'onde courte UV réticule l'ADN paternel. Cependant, les spermatozoïdes sont encore capables de déclencher l'activité de l'oeuf et les événements liés au développement zygotique. Lors de l'activation métabolique, l'œuf va compléter la méiose II, et de procéder à développer avec seulement une copie maternelle déposé de chaque chromosomoi. En raison de cette 1N ploïdie, l'embryon est soumis à des conséquences sur le développement d'un allèle mutant récessif, si elle est présente sur un chromosome maternel. Ainsi, chaque embrayage haploïde F2 contient 50% de type sauvage et 50% des embryons mutants si la mère est porteuse hétérozygote d'un allèle récessif entièrement pénétrante. Cette distribution des génotypes embryonnaires permet une relative facilité en termes d'évaluation de l'embrayage de la présence du phénotype mutant (s) d'intérêt. Si un tel phénotype est détectée, le fondateur femelle génération F1 est ensuite par croisement de type sauvage poisson zèbre mâle à créer et à mobiliser davantage de porteurs hétérozygotes. Parce qu'il n'est pas nécessaire de soulever plusieurs générations pour effectuer l'écran, le chercheur peut économiser beaucoup de temps, de travail et un espace d'aquarium, mais il a encore le pouvoir de surveiller un nombre important de génomes fondée sur le nombre de femelles F1 examiné. Ainsi, les écrans haploïdes sont particulièrement possible pour les petits laboratoires ou des projets initiés dans le absence de financement important.
Cependant, il existe plusieurs limitations et inconvénients de l'utilisation d'haploïdes. Tout d'abord, embryons de poisson zèbre haploïdes ne vivent que quelques jours, et meurent généralement entre 3 et 5 jours après la fécondation (DPF) 15. Embryons de poisson zèbre haploïdes peuvent être distingués des diploïdes en fonction de plusieurs caractéristiques, au premier rang desquels étant un corps court et trapu qui a néanmoins le nombre normal de segments somites 15,17. Comme le développement progresse, les expositions du cerveau a augmenté la mort cellulaire et la circulation est faible, généralement associée à l'accumulation de sang par 2-3 dpf et œdème 15,17. En outre, haploïdes ne parviennent pas à gonfler un 15,17 de la vessie natatoire. Indépendamment de ces différences morphologiques, la plupart des principaux organes et tissus sont formés, y compris le cœur, les yeux, et notocorde 15,17. Une caractéristique à noter sur les embrayages haploïdes, c'est qu'ils contiennent une gamme de phénotypes en termes de variétés d'embryons défectueux et #8212; une caractéristique observée dans les souches de poisson-zèbre. Ainsi, on devrait vérifier si le tissu (s) et le point d'intérêt de temps montrent le développement raisonnablement normale dans la souche haploïde de type sauvage et ont donc le potentiel d'être évalué pour les défauts génétiques dans un écran ou un projet de recherche.
Malgré ces défis, écrans haploïdes ont été mises en œuvre avec succès pour identifier les gènes nécessaires pour les processus de développement précoce dans le poisson-zèbre, et les protocoles haploïdes ont été bien établies des ressources dans la communauté depuis de nombreuses années 15-19. Plus récemment, le procédé consistant à générer des embryons de poisson haploïdes a été utilisée par les chercheurs pour créer haploïde souches embryonnaires (ES) de cultures de cellules de poissons de medaka 20,21. Après la production d'embryons haploïdes medaka in vitro, les embryons ont été utilisées pour obtenir des cultures de cellules primaires qui ont été soumises à des passages pendant environ 15 semaines, suivies par un autre 5-8 semaines pour générer des clones purs de cellules haploïdes avecES propriétés des cellules 15-19. La génération de haploïdes lignées de cellules ES de poissons détient large promesse d'avenir pour l'analyse des phénotypes récessifs dans des lignées de cellules de vertébrés, et représente une nouvelle approche pour l'analyse génétique dans les années à venir. Ainsi, la production d'embryons de poisson haploïdes a de plus en plus d'applications dans le milieu de la recherche biomédicale. Cet article vidéo fournit une démonstration visuelle des étapes de la production d'embryons de poisson zèbre haploïdes in vitro en utilisant le sperme inactivé aux UV basée sur des protocoles établis 15-19,22.
Dépistage haploïde est une technique utile pour découvrir des gènes essentiels nécessaires pour les stades précoces du développement. En outre, la culture de cellules haploïdes du poisson médaka a été utilisée pour isoler des lignées de cellules ES-like qui ont de nombreuses applications et le potentiel de recherche, ce qui démontre que les cellules haploïdes peuvent offrir un lieu précieux pour l'avenir d'autres types d'études génétiques vertébrés 20,21. Ce protocole fournit une démonstration des méthodes impliquées dans l'exécution de la production d'embryons de poisson zèbre haploïdes par fécondation in vitro avec sperme UV inactivé. Cette méthodologie peut être utilisée pour réaliser des écrans avant haploïdes avec des poissons de F1 mutagénisée, ce qui peut être fait en utilisant le type sauvage, transgénique ou des souches mutantes pour le dépistage amplificateur / suppresseur.
Bien que le temps de dépistage en utilisant une stratégie haploïde est largement réduite par rapport au dépistage diploïde, il sera néanmoins prendre plusieurs mois. Comme nous décriLit précédemment, il ya de nombreux avantages qui existent en effectuant un écran à l'aide d'un schéma haploïde, qui peut aider à faire de nouvelles contributions à la connaissance actuelle sur un certain nombre d'événements de développement. La méthodologie de l'écran haploïde est plus efficace pour l'identification des allèles mutants récessifs que les écrans diploïdes base en raison de la réduction du temps, de l'espace, et le nombre de poissons qui sont nécessaires. Cependant, il ya plusieurs pièges à un écran haploïde. Un écran haploïde ne peut identifier des mutants dans les gènes qui sont actifs dans les premiers jours de développement, l'embryon ne peut survivre que pour un temps limité avec un génome haploïde. Les gènes qui sont exprimés plus tard dans le développement auraient besoin d'être identifiés par un procédé différent, par exemple un écran diploïde. En outre, certains organes ne se développent pas correctement dans un organisme haploïde. Il peut y avoir des anomalies anatomiques, ou un temps retardé de développement, qui peuvent causer la mutation manquer par la technique de dépistage haploïde. Jen outre, certaines souches de poissons ne se développent pas aussi bien dans un état haploïde 15. Haploïdes peuvent être classés par une série de classement de bonnes, intermédiaires et pauvres caractéristiques embryonnaires, avec un embryons étant la plus normale, B pour désigner les embryons à des défauts dans l'axe, mais une tête et la queue claire, et C / D pour désigner embryons avec méconnaissable caractéristiques (masses de cellules au sommet de boules de jaune) 15,17. Les proportions des embryons au sein de ces catégories varie selon la souche de poisson zèbre, avec un nombre accru de meilleures haploïdes de qualité les plus répandus dans certaines origines génétiques 15,17. En raison de ces facteurs, il est nécessaire de trouver une souche appropriée d'un poisson zèbre pour effectuer la mutagenèse et de croisements ultérieurs. Dans notre expérience récente, la souche de type sauvage Tübingen produit haploïdes viables pour le dépistage (comme le montrent les figures 3 et 4) si les chercheurs ont utilisé historiquement poisson zèbre AB ou AB * les souches pour expérim haploïdetation 15.
En plus de ces défis susmentionnés, pas toutes les femmes de poisson zèbre adulte amorcées vont produire un embrayage lors de l'exécution de la technique de compression. Par exemple, en travaillant avec FRA-mutagénisées Tübingen contrainte femelles, environ la moitié de toutes les femmes produit un embrayage à presser, et une fraction de ceux-ci (généralement 10-30%) étaient de mauvaise qualité de l'embryon ou n'a pas pu être fécondé. Ainsi, pour effectuer un écran haploïde, il faut prévoir de réunir au moins deux fois autant de poissons que nécessaire pour dépister le nombre souhaité de génomes (chaque femelle représente un génome projeté). Indépendamment de cette considération, les avantages de la méthode de dépistage haploïde pour couvrir un grand nombre de génomes sans animalerie massif sont en effet très important si le test se prête à l'état haploïde. Toutefois, il convient également de noter que l'étude complémentaire de la mutation (s) dans l'embrayage haploïde est entièrement tributaire de soulever avec succès unen retrempe du fondateur femelle. Comme avec n'importe quel écran, 'frappe' abord identifiés au cours du processus de sélection doit être ré-identifiés dans l'état diploïde.
Malgré les risques de l'utilisation de l'écran haploïde, il a montré de très bons résultats dans l'identification des mutants, qui ont été analysés en profondeur avec des gains perspicaces sur le terrain scientifique 15. Écrans haploïdes peuvent être mises en œuvre pour enquêter sur d'autres processus mal compris de développement des vertébrés. Utilisation haploïdes pour écrans amplificateurs et suppresseurs est une façon de gagner plus de perspicacité dans les activités et réseau de régulation d'un gène d'intérêt. La technique de criblage haploïde peut également être utilisée pour identifier des activateurs et suppresseurs de mutants qui ont déjà été isolées par des procédés tels que la mutagenèse chimique ou insertion ou génétique inverse approches comme TILLING ou TALENs. En bref, le mutant isolé précédemment peut être mutagenèse avec ENU et tamisé pour amplificateurs ou suppressors du phénotype mutant d'origine. Le mutant doit être en mesure d'atteindre le stade adulte, il est donc nécessaire d'avoir un animal hétérozygote ou homozygote mutant faible poissons pour effectuer cet écran, mais les récents progrès dans la transgenèse ont permis aux chercheurs de jupe ce problème. Apprendre à manipuler les voies du développement peut conduire à de nombreuses possibilités intéressantes, dont la perspective de parcours de perturbation pour traiter des états pathologiques.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le financement de RAW de ce qui suit: subventions des NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, et R01 DK100237; Mars of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award # 5 FY12-75; les fonds de démarrage de l'Université de Notre Dame College of Science et Département des sciences biologiques; et un don généreux à l'Université de Notre Dame de Elizabeth et Michael Gallagher, au nom de la famille Gallagher à favoriser recherche de cellule souche. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous remercions le personnel du Département des sciences biologiques pour leur soutien, et le Centre pour la recherche de poisson zèbre à Notre-Dame pour leur dévouement exceptionnel dans le soin et le bien-être de notre colonie de poisson zèbre. Nous remercions GF Gerlach pour prendre les photographies fournies à la figure 4. Enfin, nous remercions tous les membres de notre laboratoire de recherche pour leurs commentaires, discussions et insihts sur cette oeuvre.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius. | ||
Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use. | ||
Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |