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Biología

La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em> In Vitro</em> Fertilización

Published: July 14, 2014
doi:
10.3791/51708
, , , , ,
1Department of Biological Sciences,University of Notre Dame

Summary

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Abstract

El pez cebra se ha convertido en un modelo vertebrado dominante que es relevante para muchas disciplinas de estudio científico. El pez cebra son especialmente adecuados para el análisis genético de avance de los procesos de desarrollo debido a su fertilización externa, tamaño embrionario, la ontogenia rápida, y claridad óptica – una constelación de características que permiten la observación directa de eventos que van desde la gastrulación de organogénesis con un estereomicroscopio básica. Además, los embriones de pez cebra pueden sobrevivir durante varios días en el estado haploide. La producción de embriones haploides in vitro es una herramienta poderosa para el análisis mutacional, ya que permite la identificación de alelos mutantes recesivos presente en primera generación (F1) mujeres portadoras Después de la mutagénesis en la generación parental (P). Este enfoque elimina la necesidad de elevar múltiples generaciones (F2, F3, etc) que implica la cría de las familias mutantes, ahorrando así el tiempo investigador junto con la reducciónlas necesidades de espacio de pez cebra colonia, el trabajo y los costos de la cría. Aunque el pez cebra se han utilizado para llevar a cabo delante de las pantallas de las últimas décadas, ha habido una constante expansión de transgénicos y el genoma herramientas de edición. Estas herramientas ofrecen ahora una gran cantidad de formas de crear ensayos de matices para pantallas de próxima generación que se pueden utilizar para diseccionar las redes reguladoras de genes que conducen a la ontogenia de los vertebrados. Aquí se describe cómo preparar los embriones de pez cebra haploides. Este protocolo se puede implementar para nuevos futuras pantallas haploides, tales como en pantallas intensificadoras y supresores, para hacer frente a los mecanismos de desarrollo para un amplio número de procesos y los tejidos que se forman durante las primeras etapas embrionarias.

Introduction

Los procesos fundamentales que organizan el desarrollo de vertebrados están ampliamente conservados 1. Una forma eficaz de identificar los genes con un papel esencial en el desarrollo es aislar mutaciones hereditarias que conducen a defectos fenotípicos en el proceso de interés. El pez cebra, Danio rerio, es una pequeña especie de teleósteos de agua dulce pertenecientes a la familia de los peces ciprínidos que se ha convertido en un organismo modelo ampliamente utilizado para la genética del desarrollo de vertebrados en las últimas décadas 2. Huevos de pez cebra son fertilizados externamente, que permite el acceso al cigoto desde el inicio de la fertilización 3. Además, el embrión temprano es ópticamente transparente, que permite la visualización del desarrollo con un simple microscopio estereoscópico 3. Ontogenia de pez cebra es rápida, con los procesos de la escisión, la gastrulación, y la organogénesis de muchas estructuras, tales como el corazón y el riñón, en gran medida completadas en el primer día de desarrollo 3. Tque el tiempo de los estadios larvales hasta la madurez sexual tarda 2-3 meses, y los adultos son pequeños vertebrados aproximadamente 3-4 cm de longitud, por lo que muchos peces se pueden mantener en un espacio mínimo 2. Además, los adultos de pez cebra tienen alta fecundidad, con cada pez capaz de producir varios cientos de embriones por semana 2. Estos atributos han hecho que la trazabilidad de pez cebra para el avance y retroceso pantallas genéticos. El pez cebra posee un alto grado de conservación en su anatomía, biología celular y fisiología de las especies más avanzadas de vertebrados como mamíferos 2,4. De hecho, el reciente análisis de la secuencia ha demostrado que el genoma pez cebra contiene homólogos a casi el 70% de los genes humanos 5. Esta conservación ha permitido a los investigadores a utilizar el pez cebra como modelo para numerosas enfermedades humanas, incluyendo tanto embrionario y condiciones de adultos 2,4. En conjunto, estos factores han hecho que el pez cebra un excelente sistema para pantallas cuyo objetivo es identificar los genes que sonesencial para la ontogenia normal de vertebrados.

Un número de pantallas de gran escala han sido llevado a cabo en el pez cebra y han identificado varios miles de mutaciones en los genes de desarrollo 6-8. El macho adulto de pez cebra es susceptible de mutagénesis y alteraciones cromosómicas se puede generar con la relativamente alta frecuencia utilizando el etilnitrosourea mutágeno químico (ENU) 6,7 o retroviral mutagénesis de inserción 9. Hasta la fecha, se han creado más de 9.000 mutaciones hereditarias, e incluyen genes que afectan a prácticamente todos los aspectos de la embriogénesis. La comunidad pez cebra ha establecido un banco centralizado de estos mutantes en el Centro Internacional de Recursos de pez cebra (o ZIRC) 10, que ha recogido aproximadamente 5.000 alelos mutantes y transgénicos de todo el mundo. Muchas de estas mutaciones se han analizado y clonado, dando a los investigadores en todas las disciplinas biológicas información valiosa que se ha utilizado para desmenuzar numeronosotros los caminos celulares y fisiológicos a través de los puntos de vista procedentes de experimentos de pez cebra.

Aunque las pantallas delanteras han identificado un número impresionante de genes importantes, pero mucho tiene que ser apreciado por las redes de regulación genética que median una miríada de procesos. Muchas pantallas emprendidas hasta el momento no han llegado a la saturación, y por lo tanto hacia adelante, así como pantallas de genética inversa se han mantenido una piedra angular para identificar y analizar los mecanismos de la embriogénesis. Si bien hay grandes ideas que pueden extraerse de una sola línea de pez cebra mutante, un factor limitante importante en el campo ha sido históricamente el esfuerzo de mucho tiempo involucrados en la clonación posicional. Por esta razón, la identidad de muchas mutaciones inducidas químicamente ha permanecido como un misterio. Sin embargo, con la reciente llegada de los enfoques de secuenciación de todo el genoma que facilitan la clonación rápida 11-14, identificación increíblemente eficiente de mutaciones genéticas es ahora feasible.

La pantalla hacia adelante prototípico en el pez cebra es una pantalla diploide que pueden identificar mutaciones recesivas en tres generaciones 6,7 (Figura 1, columna de la izquierda). Esta técnica consiste en la generación de mutaciones en las células germinales de los padres (P) hombre, y después del apareamiento este macho con una hembra tipo salvaje. Cada uno de los descendientes de primera generación (F1) de este acoplamiento va a albergar una o más mutaciones únicas debido a las contribuciones cromosómicas del genoma paterno mutado. La progenie F1 se crían y outcrossed con tipos silvestres para crear familias F2. En la familia F2, hermanos serán ya sea de tipo salvaje o portadores heterocigotos, y se incrossed al azar para generar embragues F3 que se analizan para fenotipo (s) de interés. Los embragues F3 de portadores heterocigotos contendrán tipo salvaje 25%, 50% heterocigotos y 25% peces mutantes homocigotos. Este esquema de detección multi-generacional es eficaz, sin embargo, una desventaja importante a esto unnfoque incluye el tiempo necesario para prepararse para la pantalla: al menos 1 año de la cría de peces solo se tratara, ya que cada generación necesita alrededor de 3 meses en alcanzar la madurez sexual. Otras limitaciones de este tipo de pantalla diploide son el trabajo, el espacio y costo de la vivienda de estas generaciones.

La pantalla haploide es una alternativa que se puede utilizar para identificar y posteriormente aislar mutaciones recesivas utilizando estrategias de mutagénesis similares 15 (Figura 1, columna derecha). La producción de embriones de pez cebra haploides fue descrito por primera vez hace más de 30 años 16, y la capacidad del pez cebra normalmente diploide para desarrollar durante varios días con una ploidía cromosómica haploide ha sido utilizada para numerosos estudios genéticos desde este momento. El mayor beneficio de la pantalla haploide es que este método no implica elevar familias F2 con el fin de detectar los alelos mutantes recesivos. En lugar de ello, las hembras de la generación F1 se evalúan parala heterocigosidad de mutaciones recesivas en el proceso de interés mediante el examen de su progenie F2 en una condición haploide (Figura 1, columna derecha). En general, las medidas para procurar embriones haploides son relativamente sencillos (Figura 2). Después de la preparación de las soluciones necesarias para la manipulación de esperma, los huevos se obtienen a partir de hembras de la generación F1 por manipulación manual a fin de extruir (o "exprimir") los huevos desde el vientre. Una vez que se obtienen los huevos, que son fertilizados in vitro por exposición a luz ultravioleta (UV) de esperma inactivado. El esperma inactivado UV son incapaces de contribuir ADN viable para el huevo debido al hecho de que la longitud de onda UV corta reticula el ADN paterna. Sin embargo, los espermatozoides son todavía capaces de desencadenar la actividad de huevo y los eventos asociados con el desarrollo cigóticos. Después de la activación metabólica, el huevo será completar la meiosis II, y proceder a desarrollar con sólo la copia materna depositado de cada cromosómimí. Debido a esto ploidía 1N, el embrión está sujeto a las consecuencias en el desarrollo de un alelo mutante recesivo, si está presente en un cromosoma materno. Por lo tanto cada embrague haploides F2 contendrá 50% de tipo salvaje y el 50% los embriones mutantes si la madre es portadora heterocigota de un alelo recesivo totalmente penetrante. Esta distribución de los genotipos embrionarias permite relativa facilidad en términos de evaluar el embrague para la presencia de fenotipo mutante (s) de interés. Si se detecta un fenotipo tal, el fundador generación hembra F1 posteriormente outcrossed tipo salvaje pez cebra macho para crear y recaudar más portadores heterocigotos. Porque no es necesario levantar múltiples generaciones para realizar la pantalla, el investigador puede ahorrar un tiempo considerable, el trabajo y el espacio acuario, pero todavía tiene el poder para examinar un gran número de genomas con base en el número de hembras F1 examinado. De este modo, las pantallas haploides son especialmente factible para pequeños laboratorios o proyectos iniciados en el absence de una financiación sustancial.

Sin embargo, hay varias limitaciones y desventajas de la utilización de haploides. En primer lugar, los embriones de pez cebra haploides viven por sólo varios días, y por lo general mueren entre 3 y 5 días después de la fertilización (dpf) 15. Embriones de pez cebra haploides se pueden distinguir de los diploides basados ​​en varias características, primero entre ellos un cuerpo corto y robusto, que sin embargo tiene el número normal de segmentos somite 15,17. Dado que el desarrollo avanza, las exposiciones cerebrales aumentaron la muerte celular y la circulación es pobre, por lo general asociados con la acumulación de sangre en un 2-3 dpf y edema 15,17. Además, haploides logran inflar un 15,17 vejiga natatoria. Independientemente de estas diferencias morfológicas, se forman la mayoría de los principales órganos y tejidos, incluyendo el corazón, los ojos y la notocorda 15,17. Una característica observó sobre embragues haploides es que contienen una gama de fenotipos en términos de variedades de embriones defectuosos y #8212; una característica observada través de las cepas de pez cebra. Por lo tanto, se debe verificar si el tejido (s) y lugar de interés vez muestran el desarrollo razonablemente normal en la cepa haploide de tipo salvaje y, por tanto, tienen el potencial de ser evaluados en busca de defectos genéticos en una pantalla u otro proyecto de investigación.

A pesar de estos desafíos, pantallas haploides se han aplicado con éxito para identificar los genes necesarios para los procesos de desarrollo temprano en el pez cebra, y los protocolos de haploides han sido bien establecidos los recursos en la comunidad desde hace muchos años 15-19. Más recientemente, el proceso de generación de embriones de peces haploides se ha utilizado por investigadores para crear haploide madre embrionarias (ES) de cultivos de células de los peces medaka 20,21. Después de la producción de embriones haploides medaka in vitro, se utilizaron los embriones para obtener cultivos de células primarias que se pasaron por cerca de 15 semanas, seguido de otros 5-8 semanas para generar clones puros de células haploides conPropiedades de células madre embrionarias 15-19. La generación de peces haploides líneas de células madre embrionarias tiene amplia promesa de futuro para el análisis de fenotipos recesivos en linajes de células de vertebrados, y representa un nuevo enfoque para el análisis genético en los próximos años. Por lo tanto, la generación de embriones de peces haploides ha creciente de aplicaciones en la comunidad de investigación biomédica. Este artículo de vídeo proporciona una demostración visual de los pasos involucrados con la producción de embriones de pez cebra haploides in vitro usando el esperma inactivado por UV basado en protocolos establecidos 15-19,22.

Protocol

NOTA: Los procedimientos para trabajar con embriones de pez cebra que se describen en este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad de Notre Dame. NOTA: Aunque el siguiente protocolo proporciona una demostración de aislamiento de esperma que implica la eutanasia de los varones, el esperma puede ser recogida desde el poro genital de anestesiado viviendo pez cebra macho usando la presión abdominal suave y una microcapilar para la recogida de esperma 17,18. Exprimir de machos vivos requiere varios machos para ser utilizado con el fin de recoger la cantidad equivalente de espermatozoides que se puede obtener de una eutanasia macho 17,18. Sin embargo, los hombres que han sido sometidos a apretar siguen siendo bastante saludable y se pueden utilizar para apareamientos naturales o procedimientos posteriores in vitro 17. Siempre que sea posible, los procedimientos elegidos deben minimizar el sacrificio de peces innecesario. 1. Preparación de las soluciones y de pez cebra Cámaras de acoplamiento <ol> Preparar soluciones madre de Hank (n º 1, 2, 4, 6) y la solución de premezcla de Hank (ver tabla de Materiales) 19, a continuación, el autoclave y almacenar a 4 ° C. Seleccione el número deseado de adulto hembra de pez cebra (s) para la recolección de embrague haploides. NOTA: En base a la experiencia, el uso de un F1 mutagenizada compuesto por endogámica cepa pez cebra Tübingen, aproximadamente el 50% de las mujeres sexualmente maduras eran 'squeezable' en promedio después de cebar ellos, colocándolos en una jaula de apareamiento durante la noche con un hombre – es decir, se obtuvo un embrague mediante el procedimiento de compresión – y la mayoría de estos embragues (que oscilan entre 70-90%) producido haploides viables. Con dos investigadores que realizan la preparación haploides, aproximadamente 80 adultos F1 hembra de pez cebra se puede exprimir en una mañana. Para calcular los reactivos necesarios para el experimento haploide, factor en el tanto la tasa de compresión de la generación F1 y el número de investigadores disponibles para llevar a cabo la experiment. Tenga en cuenta que el número de hembras que producirán garras haploides de alta calidad es muy variable, con diferencias que se observan entre las hembras de pez cebra de diferentes cepas, edades y dieta de alimentos 15. Preparar jaulas de apareamiento mediante la colocación de cada pez cebra adultos hembra con un macho adultos de pez cebra en una cámara de agua del sistema de modo que están separados por un divisor durante la noche. NOTA: Las mujeres deben estar expuestos a una noche masculina para cebar o prepararlos, para el desove mediante compresión. 2. Disección de Testículos Hacer Solución Stock # 6 fresca de Hank añadiendo 0,35 g de bicarbonato de sodio a 10 ml de agua destilada. Mezclar bien para disolver el polvo de bicarbonato de sodio. Combine lo siguiente en un tubo en hielo con el fin de obtener una solución de trabajo final de la Hank tamponada para el esperma: 9,9 ml de Hanks Premix I con 100 l de solución madre # 6. Mezclar bien, entonces alícuotas 500 l de la madeja7; s solución de trabajo final en un tubo de microcentrífuga y el lugar en el hielo. NOTA: Cada 500 l alícuota se utilizó para preparar los espermatozoides desde los testículos de 4-5 pez cebra macho. Seleccione entre 4-5 pez cebra macho para cada cosecha esperma. NOTA: Esto cosechar suficiente esperma para ser recogidos, tratados y almacenados en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, que puede ser utilizado para fertilizar aproximadamente 15 nidadas haploides. Seleccione cohortes de varones con el fin de preparar tubos adicionales dependiendo de la escala del experimento. Si el pez cebra macho seleccionado son pequeñas o la disección de los testículos es incompleta, por lo general se necesitarán 5 hombres. La eutanasia de cada macho mediante el uso de una red para transferir suavemente el pescado en un plato que contiene 0,2% de tricaína para aproximadamente 5-6 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Tenga cuidado para asegurarse de que el macho ha sido sacrificado adecuadamente antes de comenzar la disección. Por lo general, esperar varios (2-3) minutos después de las branquias de los peces dejan de moverse y los pecesya no es sensible al tacto. Elija el macho suavemente con una cuchara de plástico y borre cuidadosamente seco masculino de líquido. A continuación, retire la cabeza del macho con un par de tijeras afiladas y luego cortar una incisión en la línea media ventral. NOTA: La eliminación de todo el exceso de líquido del pescado es esencial para evitar desencadenar la activación de los espermatozoides. Retire el tubo digestivo y los órganos viscerales asociados de la cavidad abdominal usando pinzas finas y colocar en un contenedor de riesgo biológico para su eliminación. Utilice unas pinzas finas para eliminar los testículos, que se encuentran a lo largo de la pared corporal dorsal, lateral a la vejiga natatoria, y tienen una apariencia blanca opaca cuando se observa bajo el microscopio estereoscópico. NOTA: Mantener los testículos intactos puede ayudar a prevenir la exposición de los espermatozoides a los fluidos corporales a base de agua y de este modo evitar la activación prematura. Coloca los testículos en la solución de los espermatozoides en el hielo y mantener el tubo en hielo como los demás testículos disecados. Repita los pasos 2.6 a 2.9 hasta que todo el males han sido disecados. Coloque los canales y todos los tejidos animales restantes en un contenedor de residuos sanitarios para la disposición institucional adecuado. 3. UV Sperm inactivación Homogeneizar los testículos suavemente moler el tubo de microcentrífuga con una mano de mortero microtubo estéril. Transferir el sobrenadante a una pequeña placa de Petri o vidrio de reloj en hielo. NOTA: No transfiera los restos de tejido junto con la solución sobrenadante. Esto creará sombras y comprometer la inactivación UV de los espermatozoides. Enjuague el tubo de espermatozoides con entre 300 a 400 l de solución de trabajo final adicional de Hank (preparado en el paso 2.2 y almacenados en hielo), y agregar este lavado sobrenadante a la pequeña placa de Petri o vidrio de reloj en el paso 3.2. Exponer el plato a los rayos UV de una lámpara de banco (254 nm) para un total de 2 min a una distancia de la fuente de la lámpara de aproximadamente 15 en (38.1 cm). NOTA: Tenga cuidado al trabajar con una lámpara UV y llevar una mascarilla ootros equipos de protección individual de los ojos. Devuelva el plato para el cubo de hielo, y luego transferir el esperma UV inactivado a un tubo de microcentrífuga fresco y almacenar la muestra en hielo. NOTA: En este punto habrá aproximadamente 800 l de UV inactivado esperma para la fertilización del embrague haploides. El esperma se debe mantener en hielo a lo largo de toda la duración del tiempo dedicado a exprimir las hembras. Esperma en frío de Hank se puede utilizar durante un máximo de 6 horas sin reducción alguna en el resultado de la fecundación. Curiosamente, otros investigadores han informado de que los espermatozoides en frío Hank es viable desde varias horas hasta varios días 18. 4. Contratación huevo del pez cebra hembra adulta y la fertilización in vitro del embrague Preparar baño de tricaína para la anestesia mediante la combinación de 20 ml de 0,2% de tricaína Stock con 80 ml de agua del sistema de pescado. Seleccione la hembra para la recolección de huevos, con una red para colocar suavemente en el plato de tricaine. Espere 2-3 minutos hasta que se anestesia la hembra y ya no responde al tacto. NOTA: Si las contracciones femeninos o provoca otros movimientos, darle tiempo adicional a sucumbir a la anestesia. Use una cuchara de plástico para levantar suavemente la hembra, decantando la solución antes de la colocación de la mujer sobre una toalla de papel para absorber el exceso de fluido. NOTA: Tenga cuidado de no dejar la solución extra en la hembra, como el líquido provocará la activación del huevo antes de la adición de los espermatozoides. Coloque la hembra en su diapositiva en una placa de Petri limpia y visualizar su vientre bajo el microscopio estereoscópico. Stroke el vientre de la mujer suavemente durante aproximadamente 10 a 20 segundos utilizando uno o dos dedos de una mano a apretar los huevos de su abdomen, por su parte apoyando la espalda de la mujer mediante la colocación de uno o dos dedos de la otra mano justo por detrás de su pared dorsal del cuerpo. NOTA: Al acariciar el abdomen de la hembra, los huevos deben salir muy fácilmente. Si los huevos no surgen del ingenioh facilidad que no es aconsejable para 'empujar con más fuerza "y la fuerza de los huevos de la hembra. Esto indica que los huevos no están presentes y / o no están listos para la fertilización, y continuó empujando se asocia con un riesgo considerable de dañar a la mujer (por ejemplo, desinflar la vejiga natatoria o causar otras lesiones internas letal). Si una mujer se aprieta pero proporciona ninguno o pocos huevos, volver a la hembra a la instalación de animales. Después de 1-2 semanas de descanso, empareje la hembra con un macho para un apareamiento natural para limpiar los restos de huevo residual. Separar las hembras que se aparean de forma natural en un tanque durante otros 1-2 semanas de descanso antes de intentar un segundo aterrizaje. Alternativamente, las hembras pueden descansar durante 4 semanas, tiempo durante el cual se pueden configurar para la monta natural 15. Utilice una sonda fina o pequeña espátula para recoger huevos de debajo de la hembra y / o su superficie de vientre. Levante suavemente la hembra y devolverla a un tanque de aislamiento debidamente etiquetado que contiene el agua del sistema de pescado. </ Li> Añadir 50 l de solución de esperma inactivado con UV para el embrague de los huevos, y se incuba a temperatura ambiente durante 30 seg tiempo durante el cual, colocar una etiqueta correspondiente al plato para seguir con el número asignado a el progenitor femenino. Añadir 1 ml de E3 a los huevos, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 min. Añadir la solución E3 suficiente para llenar la mitad del plato, y colocar los embriones a los 28 ° C para la posterior incubación. NOTA: La adición de penicilina / estreptomicina (1% (v / v) de solución de la pluma-estreptocócica que contiene 5000 unidades de penicilina y 5 mg de estreptomicina por ml) 19 a la E3 puede ayudar en la salud general de los embriones haploides. 5. Observación y manipulación de embriones haploides Después de 4-8 horas, retire los embriones fecundados desde el plato y se lavan los embriones restantes mediante la sustitución de los medios de comunicación embrión E3 E3 con solución fresca. NOTA: sin fertilizar embriones mostrarán un aspecto blanco opaco o puede mostrar una forma transparenteppearance con una sola célula deforme. Incubar hasta el punto de interés de tiempo deseado, y luego utilizar en el ensayo de pantalla deseado u otra aplicación (s) de investigación.

Representative Results

La producción de embriones haploides puede ser implementado para identificar mutaciones recesivas en la generación F2 cuando los haploides se obtienen a partir de hembras de pez cebra maduros que son los hijos de padres mutagenizadas (Figura 1). Esto ahorra tiempo y espacio en comparación con la tradicional pantalla diploide, en el que los investigadores necesitan para llevar familias F2 cuya descendencia diploide luego son evaluados para fenotipos de interés (Figura 1). Los principales pasos en el protocolo descrito en los pasos 1-5 arriba para la obtención de embriones haploides de pez cebra a través de la fertilización in vitro se esquematizan como un diagrama de flujo (Figura 2). Estos pasos implican la preparación de soluciones y la preparación previa de las hembras por la exposición a las hormonas masculinas en los tanques de apareamiento (día 1), seguido de los espermatozoides y la adquisición de huevo y la fertilización in vitro (día 2), y, finalmente, la crianza de los haploides (días 3-5) (Figura 2). Cuando comcombinado con una pantalla genética, un procedimiento de mutagénesis común en el pez cebra incluye la exposición anterior de los pez cebra adultos de tipo salvaje macho a un mutágeno (por ejemplo, a un mutágeno químico como ENU, aunque otros procedimientos, tales como retroviral basado mutagénesis se pueden implementar que también facilitar la clonación del defecto cromosómico), seguido por la cría de las hembras de tipo salvaje para crear una generación F1 mutagenizado. Estas preparaciones requieren varios meses de trabajo (aproximadamente 6 meses) sobre la base de los tiempos de generación necesarios para tipos silvestres traseras, realizar mutagénesis, y detrás la posterior mutagenizada F1 15,17,22. Otro punto importante para su consideración en el empleo de los haploides de una pantalla es la elección de la cepa de pez cebra. El * (AB estrella) cepa AB ha llegado a ser bien conocida por producir embriones haploides con mejores características globales y la salud que otras cepas 15. Sin embargo, en la cepa derivada de Tubinga criados en nuestro laboratoriohistoria, hemos observado recientemente características embriológicas que han permitido a las pantallas de éxito para las anomalías del desarrollo del sistema renal (G. y R. Gerlach Wingert, sin publicar). Adultos de pez cebra machos cepa Tübingen fueron mutagenizadas por una serie de tres tratamientos ENU, y luego cruzaron con el tipo salvaje Tübingen hembras para generar una generación F1 para el cribado. Las hembras F1 se acortarán para obtener huevos y estos huevos F2 fueron fertilizados con esperma UV inactivado. En comparación con los embragues diploides obtenidas por cruzamientos naturales de tipo salvaje padres Tübingen (Figura 3A), los embriones de estos haploid garras de tensión Tübingen muestran un tronco robusto característica más corta de la condición haploide (Figuras 3B, C). Además, los embragues haploides consisten típicamente de hermanos de embriones que muestran una gama de defectos, que se observó también (figuras 3B, C), que se sabe que varían dentro de las cepas, como se discute más adelante 15,17. </p> Estudios previos han establecido una serie de clasificación canónica, lo que corresponde a los grados de la A a la D, para categorizar la gama de defectos fenotipo haploides 15,17, y, además, haploides también se han referido en términos de los adjetivos de buena calidad, intermedio y pobre 22. Haploides grado A, que corresponde a los haploides de alta calidad, son los más normales en apariencia, con un cuerpo corto y robusto, pero en general muestran una apariencia morfológica similar a diploides 15,17,22 (compare hermanos diploides (d) en el grado A haploides (etiquetado A) hermanos, Figura 3B). Embriones haploides de la categoría A también desarrollan modesta edema pericárdico, que es una característica típica de desarrollo del pez cebra haploide 15,17,22 (Figura 3B). En comparación con los haploides de grado A, intermedio o el llamado de grado B embriones haploides (con la etiqueta B, Figuras 3B, C) ​​se distinguen por el desarrollo de un mayor acortamiento o retorcido / twisted tronco, aunque las características de la cabeza y la cola son claramente distinguibles 15,17,22. Por último, el grado C o pobre calidad haploides (también figura en algunas referencias como C / D) 15,17,22 son extremadamente defectuoso y muestran una masa desorganizada de las células en asociación con una bola de yema (etiquetado C, Figura 3C). Incluso entre la misma cepa, embragues haploides varían en la distribución de A, B, y C fenotipos que uno va a observar. Por ejemplo, el embrague haploide de una hembra de Tubinga muestra mejor desarrollo en general, con su mayoría A y B de grado descendencia haploide (Figura 3B) en comparación con haploides obtenidos a partir de una segunda hembra de Tubinga, cuyo embrague consistía en numerosas grado C descendencia haploide, así como una y fenotipos haploides B (Figura 3C). Similar variabilidad de las cepas de calificaciones de embriones haploides se han observado anteriormente en AB y AB * peces tensión así 15. A pesar de estos mordiferencias morfológicos, organogénesis de muchas estructuras procede con relativa normalidad en el embrión haploide. A pesar de que tienen un cuerpo más corto tronco, el desarrollo de órganos como los ojos y el corazón es relativamente similar a la de tipo salvaje embriones diploides, y tipos de células, tales como células de pigmento (melanóforos y xanthophores) también se puede evaluar 15. Además, se ha documentado recientemente que los pronephros o riñón embrionario, se desarrolla después de la fecundación por 1 día en el tipo salvaje haploides, de manera similar a los diploides de tipo salvaje. Como prueba de ello, el tipo de células pronephros patrón muestra el patrón prototípico de segmentos (Figura 4). Además, el fenotipo de las mutaciones recesivas que alteran el desarrollo pronephros, tales como la mutación lib que reduce la producción de ácido retinoico, muestran un patrón similar en el estado haploide en comparación con el estado diploide (Figura 4) 23,24. Esta observación está en consonancia con la de otros recesiónsive mutaciones que conducen a fenotipos similares tanto en la condición haploide y diploide, aunque esto no es siempre el caso con todas las mutaciones y debe tenerse en cuenta si la evaluación de este tipo de estrategia de pantalla 15. Un número de tejidos y órganos son típicamente anormal en haploides. Por ejemplo, los haploides muestran defectos en la circulación, comúnmente exhiben un charco de sangre, lo que puede hacer que su capacidad para estudiar algunos aspectos de la vasculogénesis limitada 15. Además, se ha observado que haploides pueden tener irregularidades en el desarrollo del oído, de tal manera que pueden ser evaluados para mutaciones que previenen la formación de vesícula ótica en su totalidad, pero no para las mutaciones que afectan los procesos sutiles involucrados con la morfogénesis de esta estructura 15. Como otro ejemplo de esto, la morfogénesis cerebro es anormal en haploides, y por lo tanto pantallas haploides para identificar las vías de desarrollo del cerebro necesarios están limitados 15. A pesar de estas limitaciones, nuestro unnálisis de desarrollo del riñón en el estado haploide (Figura 4) añade este órgano a la lista de estructuras embrionarias 'escreeneables'. Este hallazgo pone de manifiesto que una metodología pantalla haploide se puede utilizar para diseccionar los componentes genéticos de los patrones progenitoras renal y añade énfasis al sentimiento de que los enfoques de pantalla ingeniosa pueden eludir las limitaciones de la ontogenia de embriones haploides para descubrir nuevas y valiosas modelos mutantes para estudiar el desarrollo de vertebrados 15. Figura 1. Esquema de estrategias de pantalla diploides y haploides en el modelo de pez cebra. Después de la mutagénesis de la generación de los padres, la generación F1 se puede subir y utilizado ya sea para generar familias mutantes F2 que se utilizan para detectar la generación F3 en un estado diploide (izquierda ) o directamente la pantallaed en una estrategia haploides (derecha). En una pantalla de haploides, las hembras de la generación F1 sexualmente maduros se utilizan para recoger garras F2 haploides para el análisis genético. Heterocigotos portadores femeninos se identifican si aproximadamente la mitad de los haploides F2 mostrar un fenotipo mutante (embriones rojo) en comparación con los hermanos haploides de tipo salvaje (embriones amarillas). Figura 2. Haploide embrión diagrama de flujo de producción. Los principales pasos de la fertilización in vitro para producir embriones haploides se esquematiza como tareas realizadas en el día 1 (cajas de color rosa) para preparar soluciones de esperma y prime adultos de pez cebra mujeres, las tareas realizadas en el día 2 (cajas de color naranja ) para recoger y espermatozoides inactivate UV, para recoger los huevos, para fertilizar los huevos con UV inactivado esperma para generar haploides, y luego revivir la madre femenina y finallY las tareas realizadas en los días posteriores 3-5 (caja amarilla) cuando las garras se incuban hasta el punto de tiempo deseado (s) para la observación y el análisis. Figura 3. Comparación de Tübingen embriones de pez cebra cepa diploides y haploides. A) embriones diploides de tipo salvaje fueron producidos por desove natural y después se incubaron hasta que aproximadamente 30 HPF. B, C) ​​haploides embriones de tipo salvaje fueron producidos por fertilización in vitro de los embragues obtenidos a partir de la generación F1 hembras mutagenizados con el esperma inactivado por UV, y se incubaron hasta aproximadamente 30 HPF. Haploides exhibieron una serie de anomalías en el desarrollo en comparación con los embriones diploides silvestres (puntas de flecha negras, d para indicar diploide). Haploides relativamente normales tenían una, más cuerpo culatín análogo al sistema de clasificación deuna A haploides 15 (puntas de flecha de color rojo, la etiqueta A), mientras que los haploides con anomalías importantes exhibieron un eje del cuerpo severamente truncados (puntas de flecha de color púrpura, con la etiqueta B) corresponde a una calificación de B, y finalmente el grado C (puntas de flecha azules, C etiquetada) basadas en descripciones publicadas 15. Todos los embriones fueron fotografiados en vivo a una magnificación de 2.5X. Figura 4. Los patrones de desarrollo de tipos de células que componen el pronephros embrionario de órganos de riñón en haploide cepa de pez cebra de Tubinga. Tipos silvestres haploides muestra un patrón normal de tipos de células en la estructura de riñón embrionario (fila superior). El riñón embrionario consiste en un par de unidades funcionales segmentados conocidos como nefronas. El patrón segmentado de tipos de células discretas presentes en las nefronas puede visualizarse en base a todo el monte <em> in situ patrón de expresión hibridación de las transcripciones de genes que son únicos a los tipos de células diferenciadas de nefronas, que incluyen los podocitos (P) marcados por wt1b y nefrina, el túbulo contorneado proximal (PCT) marcado por slc20a1a, el túbulo proximal recto (PST ) marcado por TRPM7, el distal precoz (DE) marcado por slc12a1 y el túbulo distal tardía (DL) marcados por SLC12A3. embriones lib haploides mutantes (podocitos fila inferior) pantalla reducidos, PCT y un PST ausente, junto con una ED ampliado y el segmento de DL, similar a los embriones diploides 18 lib. Los embriones fueron fotografiados en una vista dorsal, con anterior a la izquierda, a un aumento de 10X.

Discussion

Screening haploide es una técnica útil para descubrir los genes esenciales necesarios para las etapas tempranas del desarrollo. Además, el cultivo de las células haploides de los peces medaka se ha utilizado para aislar líneas celulares ES-como que tienen numerosas aplicaciones de investigación y el potencial, lo que demuestra que las células haploides pueden proporcionar una valiosa lugar futuro para otros tipos de estudios genéticos de vertebrados 20,21. Este protocolo proporciona una demostración de los métodos involucrados con la realización de la producción de embriones de pez cebra haploides a través de la fertilización in vitro con esperma inactivado con UV. Esta metodología se puede utilizar para realizar pantallas hacia adelante haploides con F1 peces mutagenizado, que se puede hacer utilizando el tipo salvaje, transgénico o cepas mutantes para la detección del potenciador / supresor.

Aunque el tiempo de detección sistemática mediante una estrategia haploides se acorta enormemente en comparación con el cribado diploide, será, sin embargo, tardará varios meses en completarse. Como DescriCama anteriormente, hay muchos beneficios que existen al realizar una pantalla utilizando un esquema haploides, todo lo cual puede ayudar a hacer nuevos aportes al conocimiento actual acerca de cualquier número de eventos de desarrollo. La metodología pantalla haploide es más eficiente para la identificación de alelos mutantes recesivos que las pantallas basadas en diploides debido a la reducción de tiempo, espacio, y el número de peces que se necesitan. Sin embargo, hay varias trampas a una pantalla haploide. Una pantalla haploide sólo puede identificar mutantes en genes que están activos dentro de los primeros pocos días de desarrollo, como el embrión sólo puede sobrevivir por un tiempo limitado con un genoma haploide. Los genes que se expresan más adelante en el desarrollo tendrían que ser identificado por un método diferente, tal como una pantalla diploide. Además, algunos órganos no se desarrollan correctamente en un organismo haploide. Puede haber anormalidades anatómicas, o un tiempo de retraso de desarrollo, que pueden causar la mutación se puede perder por la técnica de cribado haploides. Yon Además, algunas cepas de peces no se desarrollan tan bien en una condición haploide 15. Haploides pueden clasificarse por una serie de calificaciones de buenos, intermedios y pobres características embrionarias, con una embriones es el más normal, B para designar a los embriones con defectos en el eje, pero una cabeza y una cola clara, y C / D para designar a los embriones con irreconocible características (masas de células encima de las bolas de la yema) 15,17. Las proporciones de los embriones dentro de estas categorías varía según la cepa de pez cebra, con un mayor número de mejores haploides calidad más prevalentes en particular, las bases genéticas 15,17. Debido a estos factores, es necesario encontrar una cepa adecuada de pez cebra para llevar a cabo la mutagénesis y cruces subsiguientes. En nuestra experiencia reciente, la cepa de tipo salvaje Tübingen producido haploides viables para la selección (como se muestra en las figuras 3 y 4) aunque los investigadores históricamente pez cebra han utilizado el AB o los AB * cepas para experim haploidesentación 15.

Además de estos retos anteriormente mencionados, no todas las hembras de pez cebra adultos imprimadas producirán un embrague en la realización de la técnica de compresión. Por ejemplo, en el trabajo con mutagenized-ENU hembras cepa Tübingen, aproximadamente la mitad de todas las mujeres producen un embrague a apretar, y una fracción de ellos (normalmente 10-30%) eran de mala calidad embrionaria o no podría ser fertilizado. Por lo tanto, para llevar a cabo una pantalla haploides se debe planificar para elevar al menos dos veces tantos peces como sea necesario para seleccionar el número deseado de genomas (cada mujer representa un genoma proyectado). Independientemente de esta consideración, los beneficios del método haploide de cribado para cubrir un gran número de genomas sin una instalación de animales masiva son de hecho bastante significativo si el ensayo es susceptible al estado haploide. Sin embargo, cabe también señalar que el estudio adicional de la mutación (s) identificados en el embrague haploide es totalmente dependiente de criar con éxito unn outcross del fundador femenino. Al igual que con cualquier pantalla, 'hits' identificado inicialmente durante el proceso de selección debe ser re-identificados en el estado diploide.

A pesar de los peligros de la utilización de la pantalla haploides, que ha demostrado ser un gran éxito en la identificación de mutantes, que se han analizado en profundidad con ganancias interesantes en el campo científico 15. Pantallas haploides se pueden implementar para investigar otros procesos poco conocidos del desarrollo de los vertebrados. Usando haploides para pantallas intensificadoras y supresores es una manera de obtener mayor conocimiento en las actividades y red de regulación de un gen de interés. La técnica de cribado haploides también se puede utilizar para identificar potenciadores y supresores de mutantes que ya hayan sido aislados por métodos tales como mutagénesis química o por inserción o la genética inversa enfoques como la labranza o Talens. En resumen, el mutante aislado previamente puede mutagenizó con ENU y se tamiza para potenciadores o suppressors del fenotipo mutante original de. El mutante debe ser capaz de llegar a la etapa adulta, por lo que es necesario disponer de un animal o heterocigotos una débil peces mutantes homocigotos para realizar esta pantalla, sin embargo los recientes avances en la transgénesis han permitido a los investigadores de la falda de este problema. Aprender a manipular vías de desarrollo puede dar lugar a muchas posibilidades interesantes, como la posibilidad de que las vías de perturbación para el tratamiento de estados de enfermedad.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por fondos de RAW de las siguientes opciones: subvenciones del NIH K01 DK083512, DP2 OD008470 y R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Premio Académico de Inicio # 5-FY12-75; poner en marcha los fondos de la Universidad de Notre Dame Colegio de Ciencias y el Departamento de Ciencias Biológicas; y una generosa donación a la Universidad de Notre Dame de Elizabeth y Michael Gallagher, en nombre de la familia Gallagher para fomentar la investigación con células madre. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Damos las gracias a los funcionarios del Departamento de Ciencias Biológicas por su apoyo, y el Centro de Investigación de Pez Cebra en Notre Dame por su extraordinaria dedicación en el cuidado y el bienestar de nuestra colonia de pez cebra. Agradecemos GF Gerlach para tomar las fotografías que se presentan en la Figura 4. Finalmente, agradecemos a todos los miembros de nuestro laboratorio de investigación para sus comentarios, discusiones y insights sobre este trabajo.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Hank's Stock Solution #1 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O
Hank's Premix Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5.      Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius.
Hank's Stock Solution #6 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use.
Hank's Final working solution Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
XX-Series UV Bench lamp UVP 95-0042-05 Model XX-15S Bench Lamp
XX Bench Stand (Adjustable) UVP 18-0062-01 Model XX-15 Stand
Embryo incubation dish Falcon 35-1005
50 X E3 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. 
1 X E3 Dilute 50 X E3 in distilled water
Stereomicroscope Nikon SMZ645; SMZ1000
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Referencias

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Haploid ZebrafishIn Vitro FertilizationForward Genetic AnalysisDevelopmental ProcessesMutational AnalysisTransgenic ToolsGenome EditingGene Regulatory NetworksVertebrate Ontogeny

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Kroeger Jr., P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (89), e51708, doi:10.3791/51708 (2014).
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