Производство гаплоидных эмбрионов данио по<em> Экстракорпоральное</em> Оплодотворение
Summary
The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.
Abstract
Данио стало основной позвоночных модель, которая имеет отношение к многим дисциплинам научного изучения. Данио рерио особенно хорошо подходит для прямого генетического анализа процессов развития в связи с их внешнего оплодотворения, эмбрионального размера, быстрое онтогенеза и оптической прозрачности – созвездие черт, которые позволяют прямое наблюдение событий, начиная от гаструляции в органогенеза с основной стереомикроскопа. Кроме того, эмбрионы рыбок данио может выжить в течение нескольких дней в гаплоидного государства. Производство гаплоидных эмбрионов в пробирке является мощным инструментом для мутационного анализа, так как она позволяет идентифицировать рецессивных мутантных аллелей, присутствующих в первом поколении (F1) женщин-носительниц следующие мутагенеза в родительской (P) поколения. Такой подход исключает необходимость поднять несколько поколений (F2, F3 и т.д.), включает в себя разведение мутантных семей, тем самым экономя время исследователь вместе с сокращениемпотребности в данио пространстве колонии, труда, стоимость животноводства. Хотя данио были использованы для проведения вперед экраны для последних нескольких десятилетий, имело место постоянное расширение трансгенных и геномных инструментов редактирования. Эти инструменты предлагают множество способов создания нюансы анализов для экранов следующего поколения, которые могут использоваться для дальнейшего препарировать генные регуляторных сетей, которые управляют позвоночных онтогенез. Здесь мы описываем, как подготовить гаплоидных эмбрионов рыбок данио. Этот протокол может быть реализован в новых будущих гаплоидных экранов, таких как энхансер и супрессоров экранов, для решения механизмы развития для широкого ряда процессов и тканей, которые образуют на ранних эмбриональных стадий.
Introduction
Основные процессы, которые руководят развитие позвоночных широко сохраняется 1. Мощный способ идентификации генов с эфирными ролей в развитии является изоляция наследуемые мутации, которые приводят к фенотипическим дефектов в процессе интерес. Данио, Данио рерио, является небольшой пресноводный вид костистых принадлежащие рыбы семейства карповых, которая стала широко используемой моделью организм для позвоночных генетики развития в течение последних нескольких десятилетий 2. Данио рерио яйца оплодотворены внешне, позволяя доступ к зиготы от начала оплодотворения 3. Кроме того, в начале эмбрион является оптически прозрачным, что позволяет визуализировать развития с простым стереомикроскопа 3. Данио рерио онтогенеза является быстрым, с процессами расщепления, гаструляцией, и органогенеза многих структур, таких как сердце и почки, в значительной степени завершена в течение первого дня развития 3. Тон время от личиночной стадии к половой зрелости занимает 2-3 месяцев, и взрослые мелкими позвоночными примерно 3-4 см в длину, столько рыб содержат в минимальном пространстве 2. Кроме того, данио взрослые имеют высокую плодовитость, с каждой рыбы, способную производить несколько сотен эмбрионов в неделю 2. Эти атрибуты оказали удобство манипулирования из рыбок данио для прямого и обратного генетические экраны. Данио рерио обладают высокой степенью сохранения в их анатомии, клеточной биологии и физиологии с более продвинутых видов позвоночных, как млекопитающие 2,4. В самом деле, недавний анализ последовательности показал, что геном содержит данио гомологи в около 70% человеческих генов 5. Это сохранение позволило исследователям использовать данио в качестве модели для многочисленных заболеваний человека, в том числе и эмбриональных и взрослых условиях 2,4. Взятые вместе, эти факторы сделали данио отличная система для экранов с целью выявления генов,необходим для нормального позвоночных онтогенеза.
Ряд больших экранах масштабных были проведены у рыбок данио и выявили несколько тысяч мутаций в генах развития 6-8. Данио взрослый мужчина поддается мутагенеза и хромосомные изменения могут быть получены с относительно высокой частотой с помощью химического мутагена ethylnitrosourea (ЕНУ) 6,7 или ретровирусную инсерционного мутагенеза 9. На сегодняшний день более 9000 наследственные мутации были созданы, и включают в себя гены, которые влияют практически все аспекты эмбриогенеза. Данио сообщество установило централизованного банка от этих мутантов в Международном центре данио рерио ресурсов (или Zirc) 10, который собрал около 5000 мутантных и трансгенных аллели со всего мира. Многие из этих мутаций были проанализированы и клонировали, давая исследователям через биологических дисциплин ценную информацию, которая была использована, чтобы дразнить друг от друга Numeroнас клеточные и физиологические пути через прозрения, происходящих с данио экспериментов.
Хотя вперед экраны определили внушительное число важных генов, многое еще, чтобы оценить о генетических регуляторных сетей, которые обеспечивают множество процессов. Многие экраны, предпринятые до сих пор не достиг насыщения, и, таким образом вперед, а также обратные генетические экраны остались краеугольным для выявления и анализа механизмов эмбриогенеза. В то время как есть огромные идеи, которые можно почерпнуть из какой-либо одной данио мутантной линии, основным ограничивающим фактором в области исторически была трудоемким усилия, затраченные в позиционного клонирования. По этой причине, личность многих химически индуцированных мутаций остался загадкой. Тем не менее, с появлением в последнее время весь геном подходов секвенирования, которые облегчают быстрое клонирование 11-14, невероятно эффективным идентификация генетических мутаций теперь Feasible.
Прототипом вперед экран у рыбок данио является диплоидным экран, который может определить рецессивные мутации в течение трех поколений 6,7 (рис. 1, столбец слева). Этот метод включает генерирующие мутации в репродуктивных клетках родителей (Р) Для мужчин, а затем спаривания этот мужчина с дикого типа женщины. Каждый из первого поколения (F1) потомства от этой вязки будет питать один или несколько уникальных мутаций из-за хромосомных вкладов мутировавшего отцовской генома. Потомство F1 поднимаются и скрещивали с дикими видами, чтобы создать F2 семей. В семье F2, братьев будет либо дикого типа или гетерозиготных носителей, и incrossed случайным образом генерировать F3 муфты, которые анализируются для фенотипа (ов), представляющего интерес. В F3 клатчи из гетерозиготных носителей будет содержать 25% дикого типа, 50% гетерозиготных и 25% гомозиготных мутантов рыбу. Это несколько поколений скрининг схема эффективна, однако один главный недостаток к этомухо д входит время, необходимое для подготовки к экрану: по крайней мере, 1 год только рыбного хозяйства участвует, так как каждое поколение требует около 3 месяцев, чтобы достичь половой зрелости. Другие ограничения этого типа диплоидной экране являются работы, пространство, и стоимость жилья эти поколения.
Гаплоидный экран является одним альтернативой, которая может быть использована для идентификации, а затем изолировать рецессивные мутации с использованием аналогичных стратегий мутагенеза 15 (рис. 1, правая колонка). Производство гаплоидных эмбрионов данио рерио сначала было описано более 30 лет назад 16 и способность обычно диплоидной данио разработать в течение нескольких дней с гаплоидный хромосомный плоидности была использована для многочисленных генетических исследований с этого времени. Основное преимущество гаплоидного экране в том, что этот метод не предполагает повышения F2 семьи, чтобы экран для рецессивных мутантных аллелей. Вместо этого, самки поколения F1 оценивают погетерозиготность рецессивных мутаций в процессе интересом исследуя их F2 потомства в гаплоидном состоянии (рис. 1, правая колонка). В целом, шаги, которые закупают гаплоидных зародышей относительно просты (рис. 2). После подготовки необходимых решений для обработки спермы, яйца получаются от самок F1 поколения ручного манипулирования с тем, чтобы выдавить (или "сжать") яйца от пуза. Как только яйца получаются, они оплодотворяются в пробирке под воздействием ультрафиолетового (УФ) инактивируется спермы. УФ инактивированный сперма не способны внести вклад жизнеспособной ДНК в яйцо в связи с тем, что короткий длина волны УФ сшивает отцовской ДНК. Тем не менее, сперма все еще способны вызывать яйцо активность и события, связанные с зиготического развития. По метаболической активации, яйцо завершит мейоза II, и приступить к разработке только с одной материнской хранение копию каждой chromosoя. Из-за этого 1N плоидности, эмбрион является предметом развития последствий рецессивного мутантного аллеля, если он присутствует на материнской хромосоме. Таким образом, каждый F2 гаплоидны сцепления будет содержать 50% дикого типа и 50% мутантных эмбрионов, если мать является гетерозиготным носителем полностью пенетранта рецессивного аллеля. Такое распределение эмбриональных генотипов позволяет относительную легкость с точки зрения оценки сцепления на наличие мутантного фенотипа (ов), представляющего интерес. Если такой фенотип обнаруживается, самка основатель поколения F1 впоследствии скрещивали дикого типа мужского рыбок данио, чтобы создать и собрать больше гетерозиготных носителей. Потому что это не необходимо поднять несколько поколений, чтобы выполнить экран, исследователь может значительно сэкономить время, труд, и аквариум пространство, но все еще имеет силу для обследования значительное количество геномов на основе ряда F1 женщин исследуемой. Таким образом, гаплоидные экраны особенно целесообразно для небольших лабораторий или проектов, инициированных в absencэ существенного финансирования.
Тем не менее, существует несколько ограничений и недостатков использования гаплоидов. Во-первых, гаплоидные эмбрионы рыбок данио живут всего несколько дней, и, обычно умирают от 3 до 5 дней после оплодотворения (DPF) 15. Гаплоидные эмбрионы рыбок данио можно отличить от диплоидов на основе нескольких характеристик, прежде всего среди них быть короткой и коренастый тело, которое, тем не менее имеет нормальный ряд сомитных сегментов 15,17. По мере продвижения разработки, экспонаты мозга увеличилась гибель клеток и кровообращение плохое, как правило, связаны с объединения крови на 2-3 DPF и отека 15,17. Кроме того, гаплоиды не в состоянии надуть 15,17 плавательного пузыря. Независимо от этих морфологических различий, большинство крупных органы и ткани образуются, в том числе сердца, глаз и хорды 15,17. Одной из особенностей отмечено о гаплоидных муфт в том, что они содержат ряд фенотипов в плане сортов дефектных эмбрионов и #8212; особенность наблюдается по штаммов данио. Таким образом, следует проверить, если ткань (ы) и время достопримечательность показывают достаточно нормальное развитие в дикого типа гаплоидного деформации и, следовательно, есть потенциал, чтобы быть оценена для генетических дефектов в экран или другой научно-исследовательского проекта.
Несмотря на эти проблемы, гаплоидные экраны были реализованы успешно, чтобы идентифицировать гены, необходимые для начала процессов развития в данио, и гаплоидные протоколы были хорошо известны ресурсов в обществе на протяжении многих лет 15-19. Совсем недавно, процесс создания гаплоидных зародышей рыб была использована исследователями для создания гаплоидный эмбриональных стволовых (ES) клеточных культур от оризия рыбы 20,21. После производства оризии гаплоидных эмбрионов в пробирке, эмбрионы были использованы для получения первичных клеточных культур, которые пассировали в течение приблизительно 15 недель с последующим еще 5-8 недель, чтобы генерировать чистые клоны гаплоидных клеток сES клеток свойства 15-19. Поколение рыбы гаплоидных клеточных линий ES имеет широкий будущей перспективы для анализа рецессивных фенотипов в позвоночных клеточных клонов, и представляет собой новый подход к генетического анализа в ближайшие годы. Таким образом, поколение гаплоидных зародышей рыб уже растет приложений в биомедицинских исследований сообщества. Это видео статья обеспечивает визуальное демонстрацию этапов с производством гаплоидных данио эмбрионов в пробирке с использованием УФ-инактивируется сперму на основе установленных протоколов 15-19,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Гаплоидных скрининг может быть полезен, чтобы обнаружить существенные гены необходимые для ранних стадий развития. Кроме того, культивирование гаплоидных клеток из оризия рыбы был использован для изоляции ES-подобные клеточные линии, которые имеют многочисленные исследовательские приложений и потенциал, демонстрируя, что гаплоидные клетки могут обеспечить ценную будущего места для других типов генетических исследований позвоночных 20,21. Этот протокол обеспечивает демонстрацию методов, связанных с выполнением производство гаплоидных эмбрионов данио рерио через экстракорпорального оплодотворения с УФ инактивируется спермы. Эта методика может быть использована для выполнения вперед гаплоидных экраны с мутагенезу рыбы F1, которые могут быть сделаны с использованием дикого типа трансгенные или мутантные штаммы, для энхансер / супрессора скрининга.
Хотя время скрининга с использованием гаплоидный стратегии является значительно сокращен по сравнению с диплоидной скрининга, оно, тем не менее занять несколько месяцев, чтобы закончить. Как мы descriкровать ранее, Есть много преимуществ, которые существуют, выполняя экран с помощью гаплоидный схему, все из которых могут помочь в создании новых взносов в современных знаний о любом количестве событий в развитии. Методология Гаплоидный экран является более эффективным для идентификации рецессивных мутантных аллелей, чем диплоидных основе экранов в связи с сокращением времени, пространства и количества рыбы, которые необходимы. Тем не менее, есть несколько подводных камней в гаплоидном экране. Гаплоидны экран может только идентификации мутантов в генах, которые активны в течение первых нескольких дней развития, как эмбрион может выжить только в течение ограниченного времени с гаплоидный геном. Гены, которые выражаются затем в развитии должны быть определены другим способом, например, диплоидной экране. Кроме того, некоторые органы не развиваются должным образом в гаплоидном организма. Там могут быть анатомические аномалии, или с задержкой времени развития, которые могут привести мутация будет хватать на гаплоидного метод скрининга. Ян Кроме того, некоторые штаммы рыбы не развиваются, а в гаплоидного состоянии 15. Гаплоиды могут быть классифицированы по классификации серии хороших, средних и плохих эмбриональных особенностей, с эмбрионы быть самый нормальный, B для обозначения эмбрионов с дефектами в оси, но ясно, голова и хвост, и C / D для обозначения эмбрионов с неузнаваемым особенности (массы клеток на вершине желтка шаров) 15,17. Пропорции эмбрионов в рамках этих категорий зависит от данио штамма, с увеличением числа более качественных гаплоидов наиболее распространенных в частности генетическим фоном 15,17. В силу этих факторов, необходимо найти правильный штамм рыбок данио для выполнения мутагенеза и последующие кресты. В нашем недавнем опыте, дикого типа Тюбинген штамм производится жизнеспособных гаплоиды скрининга (как показано на рисунках 3 и 4), хотя исторически данио исследователи использовали AB или AB * штаммы для гаплоидного Эксперимтации 15.
В дополнение к этим вышеупомянутых проблем, не все загрунтованные взрослых самок данио будет производить сцепление на выполнении методики сжатия. Например, при работе с ENU-мутагенизированных деформации самок Tubingen, приблизительно половина всех женщин производится сцепление на сжатие, а некоторые из них фракция (обычно 10-30%) были низким качеством эмбрион или не могли быть оплодотворены. Таким образом, для выполнения гаплоидный экран нужно планируют поднять минимум в два раза столько рыбы, как нужно экранировать нужное количество геномов (каждая самка является одним геном скрининг). Независимо от этого рассмотрения, преимущества гаплоидного метода скрининга для покрытия большого количества геномов без массивного объекта животного действительно весьма значительным, если анализ поддается гаплоидного государства. Тем не менее, следует также отметить, что дальнейшее изучение мутации (ы) определены в гаплоидного сцепления полностью зависит от успешного привлечениян ауткросс от женской основателя. Как и в любом экране, 'парад' первоначально определены в процессе скрининга необходимо заново определены в диплоидной государства.
Несмотря ловушек с использованием гаплоидный экран, он показал, чтобы быть очень успешным в выявлении мутантов, которые были проанализированы в глубину с проницательными выгоды для научной области 15. Гаплоидные экраны могут быть реализованы для исследования других мало изученных процессов развития позвоночных. Использование гаплоиды для усилителей и супрессоров экранов является одним из способов, чтобы получить более глубокое представление о деятельности и регуляторной сети интересующего гена. Гаплоидный метод скрининга также может быть использован для идентификации энхансеры и ограничителей мутантов, которые уже были изолированы с помощью методов, таких как химическая или инсерционного мутагенеза или обратной генетики подходы, такие как ТИЛЛИНГ или Talens. Короче говоря, ранее выделен мутант может быть мутагенезу с ЕНУ и подвергают скринингу на усилители или сuppressors исходного мутантного фенотипа. Мутант должны быть в состоянии достигнуть взрослых этапы, поэтому необходимо иметь гетерозиготное животное или слабый гомозиготных мутантов рыбу выполнять этот экран, однако последние достижения в трансгенеза позволили исследователям обойти эту проблему. Научиться управлять путей в развитии может привести к много интересных возможностей, включая перспективой возмущающих путей для лечения болезненных состояний.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансирование в RAW из следующих функций: NIH гранты K01 DK083512, DP2 OD008470 и R01 DK100237; Марш Dimes Василий О'Коннор Стартер Академия Award # 5-FY12-75; запуска средства из Университета Нотр-Дам колледж науки и Отделения биологических наук; и щедрый подарок в Университет Нотр-Дам от Элизабет и Майкл Галлахер от имени Галлахер семьи, чтобы способствовать исследования стволовых клеток. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбор и анализ данных, решение о публикации или подготовки рукописи. Мы благодарим штабы Отделения биологических наук за их поддержку, и Центр данио рерио исследований в Нотр-Дам за их выдающуюся преданность в обслуживании и благосостояния нашей данио колонии. Мы благодарим GF Герлах для принятия фотографии, предоставленные на рисунке 4. Наконец, мы благодарим всех членов нашей исследовательской лаборатории для своих комментариев, дискуссий и InsigHTS об этой работе.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
Referencias
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-26 (1996).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-43 (1996).
- Eisen, J. S. Zebrafish make a big splash. Cell. 87, 969-977 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Bowen, M. E., et al. Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing. Genética. 190, 1017-1024 (2012).
- Leshchiner, I., et al. Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing. Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).
- Obholzer, N., et al. Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing. Development. 139, 4280-4290 (2012).
- Voz, M. L., et al. Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing. PLoS ONE. 7, (2012).
- Walker, C. Haploid screens and gamma ray mutagenesis. Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).
- Steisinger, G., et al. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
- Westerfield, M. Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.”. The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).
- Walker, C., et al. Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure. (28), (2009).
- Westerfield, M. Chapter 10: Recipes.”. The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells. Science. 326, 430-433 (2009).
- Yi, M., Hong, N., Hong, Y. Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish. Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).
- Layton, J. E. . Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.” Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , (2009).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
