Çok ilaca dirençli Demonstrating<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Amplifikasyon Microarray
Summary
Bir amplifikasyon mikrodizi önemli ölçüde son kullanıcı için mikro-dizi iş akışını tek bir oda içine asimetrik PCR amplifikasyonu ve mikrodizi hibridizasyon birleştirir. Mikrodizi iş akışı basitleştirilmesi rutin alt-kaynak ortamlarda kullanılabilir mikroarray tabanlı tanı oluşturmak için gerekli bir ilk adımdır.
Abstract
Mikrodizi iş akışı basitleştirilmesi rutin alt-kaynak ortamlarda kullanılabilir ÇİD-TB mikroarray tabanlı tanı oluşturmak için gerekli bir ilk adımdır. Bir amplifikasyon mikroarray tek bir çözüm içinde ve tek bir mikroakışkan odasına asimetrik PCR, hedef boyutu seçimi, hedef etiketleme ve mikroarray hibridizasyon birleştirir. Bir toplu işleme yöntemi çoklu ilaca dirençli Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) genotiplemeye 9-karmaşık asimetrik ana karışımı ve düşük yoğunluklu jel elemanı mikrotertipte ile gösterilmiştir. Burada açıklanan protokol 6 saat içinde tamamlanmış ve genomik DNA'sının en az 1000 hücre eşdeğer doğru genotipleme temin edilebilir. Çip üzerinde yıkama adımları birleştirilerek tamamen kapalı bir amplikon, yöntem ve sistem ile sonuçlanır ki, mümkündür. Bir amplifikasyon mikroarray ile çoğullama ölçüde sonuçta tek bir ana m birleştirilebilir primer çiftlerinin sayısı ile kısıtlanırix ve hala oldukça dizide hareketsiz olan probların sayısından daha istenen duyarlılık ve özgüllük performans ölçümleri, başarmak. Aynı şekilde, toplam analiz süresi belirli bir kullanım amacı, araştırma sorusu ve tespiti istenen sınırları bağlı olarak kısaltılabilir veya uzatılabilir. Bununla birlikte, genel bir yaklaşım önemli ölçüde elle yoğun ve zaman alıcı bir işlem adımlarının sayısını azaltarak son kullanıcı için mikroarray iş akışını düzenler, ve rutin klinik uygulamaya mikroarray tabanlı tanı çeviri için basitleştirilmiş bir biyokimyasal ve mikroakışkan yolu sağlar.
Introduction
Erken vaka tespiti ve hızlı tedavi Mycobacterium tuberculosis (MTB) iletim 1 azaltmak için en etkin kontrol stratejileri kabul ve bakım (POC) veya POC testinde yakın bir noktadan aynı anda TB teşhis TB toplumda geniş bir mutabakat bulunmaktadır vardır ve ilaç direnci (DR) gereklidir. Böyle Sefeid en GeneXpert ve diğer nükleik asit amplifikasyon testleri gibi teknolojiler birçok TBC hastaları için tanı süresini azaltmak, ve rifampin veya diğer birinci veya ikinci basamak ilaçlara 2 direnç kazandıran seçilen mutasyonlara karşı direnç gösteren bir hızlı okuma-çıkış sağlamak. Gerçek zamanlı ve izotermal nükleik asit amplifikasyon testleri MDR-TB yol açan ilaç direnç mutasyonları tanımlamak için tasarlanmış olsa da, bunlar tespit mutasyonların spektrumu, hastanın ilaç direnci profiline karşılık gelen kişiselleştirilmiş bir ilaç rejimi tasarımı genellikle yetersizdir ve ilgili teknik kısıtlarıoptik çapraz konuşma veya amplifikasyon ve raporlama kimyaları karmaşıklığına 3-7 loci veya tespit edildiği mutasyonların sayısını sınırlandırabilir. Böylece, yüksek çoklayıcı kapasiteli algılama teknolojileri ÇİD-TB POC teşhis bilinen boşlukları gidermek için gereklidir.
Mikroarray'ler ve WHO onaylı Hain hat prob deneyleri ÇİD-TB 8-29 teşhis "birden fazla gen, multipl mutasyonlar" aşabilirsiniz. Ne yazık ki, bu hibridizasyon temelli, mültipleksli algılama platformları çok adımlı, karmaşık ve moleküler teknikler önemli eğitim ve uzmanlık gerektiren açık Amplikon protokollerini kullanır. Amplifikasyon Mikrodizi 30 bu mikroarray iş akışı ve operasyonel bazı endişelerini gidermek için tasarlanmıştır. Basitleştirilmesi akışkan ilkeleri, yükseltmek hibridize olan ve tek bir mikroakışkan odası içinde nükleik asit hedefleri tespit etmek için bulunmaktadır. Kullanıcı, nükleik asit amplifikasyonu ve mas getirmektedirter bir pipet ile bir akışkan odasına karıştırın ve termal döngü protokolü başlar. Burada gösterilen toplu işlem yöntemi için, mikro sıraları, daha sonra, yığın solüsyonu ile yıkanır, kurutulur ve görüntülü. Bu çalışma rpoB için bir ÇİD-TB mikroarray test (30 mutasyon), katG (2 mutasyonları), Inha (4 mutasyonlar), rpsL (2 mutasyonları), embB (1 mutasyon), IS1245, IS6110 kullanarak bir amplifikasyon mikrotertibin işlevselliğini gösteriyor ve bir iç amplifikasyon ve hibridizasyon kontrolü. Mikrodizi sondalar (vahşi tip (WT) ve tek nükleotid mutant (MU)) en az bir çift eşleşen ilgi her mutasyon için dahil edilir. Çoklu ilaç dirençli M. saflaştırılmış nükleik asitleri tüberküloz TDR Verem Zorlanma Bankası 31 vardır. Başka bir yerde tarif edildiği gibi 32 Gel elemanı mikroarrayleri biz polymeriz her sonda% 4 monomer ve 0.05 mM kullanmak dışında, esas olarak kopolimerizasyonu ile, cam alt-tabakalar üzerinde üretilmektediration karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Diziler, kullanımdan önce, 50 ml conta ile çevrilidir. Termal bisiklet, melezleme ve yıkama aşamalarından sonra, amplifikasyon mikroarray'ler bir Akonni taşınabilir analizörü ile görüntülenmiş. Background-düzeltilmiş, entegre sinyal yoğunlukları ham elde edilir. Sabit bir daire algoritma kullanarak tif görüntüler. Her jel elemanı için Gürültü yerel nokta kökenden üç kat standart sapma olarak hesaplanmıştır. Gürültü oranı (SNR) sinyal için ≥ 3 değerleri gen hedefleri tipik bir şekilde saptanabilir kabul edilir. Her bir gen ya da kodon belirgin bir mutasyonun varlığını veya yokluğunu belirlemek için, ayırt edici bir oranı (WT-MU) / (WT + MU) halinde SNR değerlerinden hesaplanır. Discriminant oranları 0, vahşi tip dizisinin göstergesidir <oranları ise 0, lokusuna bir ilaç-dirençli mutasyon göstergesidir>.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir amplifikasyon mikroarray ile çoğullama ölçüde sonuçta katlı asimetrik PCR verimi değil, mikrodizi tarafından belirlenir. Bizim tecrübelerimize göre, 10-12 benzersiz primer çiftleri kolaylıkla bir amplifikasyon mikroarray formatında çoğaltılmış olabilir. Geleneksel primer ve prob tasarım kriterleri, bu nedenle, bu çözelti, bir de-faz nükleik asitler ve hareketsiz mikrodizi prob, bir PCR tamponu içinde termal termal döngü verimliliği ve prob hibridizasyon davranış arasındaki olası etkile…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma hibe RC3 AI089106 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir.
MDR-TB nükleik asitler Tropikal Hastalıklar (TDR), Cenevre, İsviçre Araştırma ve Eğitim için Birleşmiş Milletler Çocuk Fonu / Birleşmiş Milletler Kalkınma Programı / Dünya Bankası / Dünya Sağlık Örgütü Özel Programı tarafından sağlanmıştır.
Biz prototip tahlilde dahil spesifik genlerin ve mutasyonların rehberlik için Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri ABD Dr Tom Shinnick teşekkür ederim.
Materials
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
Referencias
- Lemaire, J. -. F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
- World Health Organization. . Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, (2012).
- Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
- Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
- Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
- Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
- Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
- Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
- Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
- Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
- Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
- Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
- Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
- Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
- Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
- Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
- Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
- Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
- Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
- Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
- Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
- Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
- Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
- Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
- Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
- Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
- Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
- Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
- Sekiguchi, J. -. I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
- Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
- Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
- Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
- Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
- Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
- El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
- Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
