JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة<em> السل المتفطرة</em> التضخيم ميكروأري

Published: April 25, 2014
doi:
10.3791/51256
, , , , , , ,
1Akonni Biosystems, Inc.

Summary

وميكروأري التضخيم PCR التضخيم غير المتماثلة يجمع وميكروأري التهجين في غرفة واحدة، والذي يبسط إلى حد كبير سير العمل ميكروأري للمستخدم النهائي. تبسيط سير العمل ميكروأري هو خطوة أولى ضرورية لخلق التشخيص القائم على ميكروأري التي يمكن استخدامها بشكل روتيني في البيئات ذات الموارد أقل.

Abstract

تبسيط سير العمل ميكروأري هو خطوة أولى ضرورية لخلق السل المقاوم للأدوية المتعددة التشخيص القائم على ميكروأري التي يمكن استخدامها بشكل روتيني في البيئات ذات الموارد أقل. وميكروأري التضخيم PCR التضخيم غير المتماثلة يجمع، واختيار حجم الهدف، ووضع العلامات المستهدفة، وميكروأري التهجين ضمن حل واحد وإلى غرفة ميكروفلويديك واحد. ويتجلى أسلوب تجهيز الدفعات مع مزيج الرئيسي غير المتماثلة 9-بلكس ومنخفض الكثافة عنصر هلام ميكروأري التنميط الجيني للأدوية المتعددة والسل المتفطرة مقاومة (السل المقاوم للأدوية المتعددة). بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تكتمل في 6 ساعة وتوفير التنميط الجيني الصحيح مع ما لا يقل عن المعادل 1،000 خلية من خلايا الحمض النووي الجيني. دمج على رقاقة خطوات غسل غير مجدية، الأمر الذي سيؤدي في طريقة AMPLICON مغلقة تماما والنظام. مدى مضاعفة مع ميكروأري التضخيم مقيدة في نهاية المطاف من قبل عدد من أزواج التمهيدي التي يمكن دمجها في رئيسية واحدة مالتاسع ومازال تحقيق حساسية المرجوة ومقاييس الأداء والنوعية، بدلا من عدد من التحقيقات التي يجمد على صفيف. وبالمثل، فإن مجموع الوقت التحليل يمكن اختصارها أو تطول تبعا لاستخدام محدد المقصود، سؤال البحث، وحدود المطلوب من الكشف. ومع ذلك، فإن النهج العام يبسط إلى حد كبير سير العمل ميكروأري للمستخدم النهائي عن طريق تقليل عدد الخطوات مكثفة وتستغرق وقتا طويلا يدويا التجهيز، ويوفر طريقا البيوكيميائية وميكروفلويديك مبسطة لترجمة التشخيص القائم على ميكروأري في الممارسة السريرية الروتينية.

Introduction

وتعتبر اكتشاف الحالات المبكر والعلاج السريع للاستراتيجيات المكافحة الأكثر فعالية للحد من المتفطرة السلية (MTB) نقل 1، وهناك الآن توافق واسع في المجتمع السل أن نقطة الرعاية (مركز عمليات) أو بالقرب من مركز عمليات اختبار لتشخيص السل في وقت واحد وهناك حاجة المقاومة للأدوية (DR). تقنيات مثل GeneXpert Cepheid وغيرها من اختبارات الحمض النووي التضخيم تقليل الوقت لتشخيص لكثير من مرضى السل، وتقديم قراءة التدريجي السريع تشير إلى المقاومة ريفامبين أو الطفرات اختيارها تمنح المقاومة لغيرها من أدوية الخط الأول أو الثاني 2. على الرغم من أن مصممة في الوقت الحقيقي واختبارات الحمض النووي متساوي التضخيم لتحديد الطفرات المقاومة للعقاقير التي تؤدي إلى مرض السل المقاوم للأدوية المتعددة، فإن الطيف من الطفرات التي غالبا ما تكون غير كافية كشف لتصميم نظام المخدرات فردية المقابلة لملف المقاومة للأدوية للمريض، والقيود الفنية المتعلقةلالبصرية عبر الحديث أو تعقيد التضخيم والإبلاغ كيمياء مايو 3-7 تحديد عدد مواضع أو الطفرات التي يتم الكشف عنها. وبالتالي، هناك حاجة تكنولوجيات الكشف بسعة مضاعفة أعلى لمعالجة الثغرات المعروفة في التشخيص POC السل المقاوم للأدوية.

يمكن ميكروأرس وأيدت منظمة الصحة العالمية، هين المقايسات خط التحقيق مواجهة "الجينات متعددة، والطفرات متعددة" تحديا لتشخيص السل المقاوم للأدوية المتعددة 8-29. للأسف، هذه، المنصات كشف المضاعفة القائم على التهجين استخدام متعددة الخطوات، معقدة، والبروتوكولات AMPLICON المفتوح التي تتطلب التدريب الهامة والكفاءة في التقنيات الجزيئية. تم تصميم ميكروأري التضخيم 30 لمعالجة بعض هذه ميكروأري تدفق العمل والاهتمامات التشغيلية. مبادئ فلويديك تبسيط هي لتضخيم، هجن، وكشف الأهداف الحمض النووي داخل غرفة ميكروفلويديك واحد. المستخدم يدخل حمض النووي والتضخيم ماسثالثا خلط في غرفة فلويديك مع ماصة ويبدأ بروتوكول الدراجات الحرارية. للأسلوب تجهيز الدفعات المعروضة هنا، يتم غسلها بعد ذلك في حل ميكروأرس السائبة، والمجففة، وتصويرها. وتوضح هذه الدراسة وظائف لميكروأري التضخيم باستخدام اختبار السل المقاوم للأدوية المتعددة ميكروأري لrpoB (30 الطفرات)، katG (2 الطفرات)، INHA (4 طفرات)، rpsL (2 الطفرات)، embB (1 الطفرة)، IS1245، IS6110 ، والتضخيم الداخلية والسيطرة التهجين. يتم تضمين واحد على الأقل زوج متطابق من تحقيقات ميكروأري (wildtype (WT) ومتحولة واحدة النوكليوتيدات (MU)) لكل طفرة من الاهتمام. الأحماض النووية تنقيته من مقاومة M. أدوية المتعددة السل هي من سلالة السل تقرير التجارة والتنمية 31 بنك. يتم تصنيع ميكروأرس عنصر هلام على ركائز الزجاج بواسطة البلمرة أساسا كما هو موضح في مكان آخر 32، إلا أن نستخدم 4٪ و 0.05 ملي مونومر كل التحقيق في polymerizخليط أوجه. وتحيط صفائف مع طوقا 50 مل قبل استخدامها. بعد ركوب الدراجات الحرارية، والتهجين، وغسل الخطوات، يتم تصوير ميكروأرس التضخيم على محلل المحمولة Akonni. ويتم الحصول على لتصحيح الخلفية، شدة إشارة متكاملة من الخام. معرض طرابلس الصور باستخدام خوارزمية دائرة ثابتة. يتم احتساب الضوضاء لكل عنصر هلام إلى ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري من الخلفيات بقعة المحلية. تعتبر الأهداف الجين عادة للكشف عن إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) تقدر ≥ 3. من أجل تحديد وجود أو عدم وجود طفرة محددة في كل الجينات أو رامزة، ويتم احتساب نسبة التمايز من القيم SNR باسم (WT-MU) / (WT + MU). نسب التمايز <0 تدل على طفرة مقاومة المخدرات في مكان الجريمة، في حين أن نسب> 0 تدل على تسلسل من النوع البري.

Protocol

للمختبرات التي تتبع الاحتياطات العالمية PCR، فمن الناحية العملية أكثر كفاءة لتشمل العديد من ميكروأرس التضخيم وحشيات في الركيزة وغسل جميع ميكروأرس التضخيم في وقت واحد في حاوية كبيرة، كما هو موضح هنا. تنسيقات الاستهلاكية المتوفرة لأداء آخر التضخيم غسل ميكروأري الخطوا…

Representative Results

يمكن تحليل الصور النوعية توفر نظرة ثاقبة مصادر الضوضاء التجريبية أو تقلب التي تتحدى لتحديد الجداول في البيانات التي تولدها الآلي برمجيات تحليل الصور. وبالتالي، يمكن أن يكون مفيدا لبصريا التأكد من أن 1) جميع عناصر هلام سليمة وغير التالفة، 2) الخلفية العالمية غير خالية…

Discussion

مدى مضاعفة مع ميكروأري التضخيم وأملت في نهاية المطاف من كفاءة متعددة غير المتماثلة PCR، وليس ميكروأري. في تجربتنا، 10-12 أزواج التمهيدي فريدة من نوعها يمكن بسهولة المضاعفة في شكل التضخيم ميكروأري. وبالتالي تطبيق التمهيدي والتحقيق معايير التصميم التقليدية لفحوصات جديد?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) في إطار منحة RC3 AI089106.

وقدمت السل المقاوم للأدوية المتعددة الأحماض النووية من قبل برنامج الأمم المتحدة للطفولة برنامج / صندوق الأمم المتحدة للتنمية / البنك الدولي / منظمة الصحة العالمية الخاص للبحوث والتدريب في مجال أمراض المناطق المدارية، جنيف، سويسرا.

نشكر الدكتور توم Shinnick من المراكز الامريكية لمكافحة الامراض والوقاية منها لتوجيهات بشأن الجينات والطفرات محددة لتدرج في مقايسة النموذج.

Materials

MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips Akonni Biosystems Inquire
Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus Qiagen #206143
Taq polymerase Qiagen #201207
RNAse-free water Qiagen #206143 
Formamide Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP227-500
20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich #3B6917
5X concentrated MDR-TB primer mix Akonni Biosystems Inquire
500 fg uL-1 amplification and inhibition control Akonni Biosystems Inquire
20X SSPE Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific, Inc. #BP151-500
Disinfecting Spray  Current Technologies, Inc. #BRSPRAY128
70% Isopropyl Alcohol Decon Labs, Inc. #8416
Equipment Company  Catalog Number 
Microarray imager, with automated image and data analysis software Akonni Biosystems 100-20011
Thermal cycler with flat block insert Akonni Biosystems 100-10021
High-throughput wash station and slide holder ArrayIt HTW
Dissecting forceps Thermo Fisher Scientific, Inc. #10-300
Mini Vortexer VWR #3365040
Mini-centrifuge VWR #93000-196
Airbrush Compressor Kit Central Pneumatic #95630
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Lemaire, J. -. F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40 (2010).
  2. World Health Organization. . Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, (2012).
  3. Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63 (2000).
  4. Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
  5. Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
  6. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  7. Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
  8. Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
  9. Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
  10. Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
  11. Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94 (2008).
  12. Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
  13. Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
  14. Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
  15. Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
  16. Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
  17. Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
  18. Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
  19. Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
  20. Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
  21. Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
  22. Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
  23. Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
  24. Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
  25. Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
  26. Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
  27. Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
  28. Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
  29. Sekiguchi, J. -. I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
  30. Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
  31. Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
  32. Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
  33. Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
  34. Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
  35. El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
  36. Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).

Tags

Multi-drug Resistant Mycobacterium TuberculosisMDR-TBAmplification MicroarrayAsymmetric PCRTarget Size SelectionTarget LabelingMicroarray HybridizationMicrofluidicBatch ProcessingGenotypingOn-chip WashClosed Amplicon MethodMultiplexingLimits Of DetectionMicroarray-based DiagnosticsClinical Practice

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Linger, Y., Kukhtin, A., Golova, J., Perov, A., Qu, P., Knickerbocker, C., Cooney, C. G., Chandler, D. P. Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray. J. Vis. Exp. (86), e51256, doi:10.3791/51256 (2014).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image