Summary

Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием

Published: January 17, 2014
doi:

Summary

Здесь мы описываем фенотипическое анализ, применимый к высокой пропускной способности / высокое содержание экранов малых помех синтетической РНК (siRNA), химическое соединение, и Mycobacterium туберкулеза мутант библиотек. Этот метод опирается на обнаружение флуоресцентно помечены Mycobacterium туберкулеза в флуоресцентно помечены клетки-хозяина с использованием автоматизированной конфокальные микроскопии.

Abstract

Несмотря на наличие терапии и вакцины, туберкулез (ТБ) остается одной из самых смертоносных и распространенных бактериальных инфекций в мире. На протяжении нескольких десятилетий внезапный всплеск штаммов с множественной и широко лекарственной устойчивостью представляет собой серьезную угрозу для борьбы с туберкулезом. Поэтому необходимо определить новые целевые показатели и пути, критически важные для причинного агента туберкулеза, микобактерий туберкулеза(МТБ),и найти новые химические вещества, которые могут стать противотуберкулезными препаратами. Один из подходов заключается в разработке методов, подходящих для генетических и химических экранов крупномасштабных библиотек, позволяющих искать иголку в стоге сена. С этой целью мы разработали фенотипический анализ, опираясь на обнаружение флуоресцентно помечены Mtb в флуоресцентно помечены принимающих клеток с использованием автоматизированной конфокалипической микроскопии. Этот анализ in vitro позволяет количественно оценить процесс колонизации Mtb в хост и был оптимизирован для формата микроплюса 384-ну, который является правильным для экранов siRNA-, химического соединения- или Mtb мутант-библиотек. Изображения затем обрабатываются для мультипараметрического анализа, который обеспечивает считыв вывод о патогенеза Mtb в клетках-хозяинах.

Introduction

Среди новых и вновь возникающих инфекционных патогенов, зарегистрированных в последние годы, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) занимает видное место, отвечая за 1,4 миллиона смертей и 8,7 миллиона новых инфекций в 2011 году (Глобальный доклад о туберкулезе 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Несмотря на наличие мультимедикаментозной терапии, число инфицированных людей по-прежнему растет, и мультимедикаментозная устойчивость (МЛУ), а также широко устойчивый к лекарственным средствам (XDR) Mtb быстро распространяется по всемумиру 1. Кроме того, принимая во внимание наличие Mtb антигенов, очевидно, что одна треть мирового населения считается скрыто инфицированных Mtb. Статистически, в одном случае из десяти, есть эволюция к активной форме заболевания с последующими клиническими симптомами2. Поэтому срочно нужны новые средства борьбы с МТБ. В этом контексте мы разработали визуальный фенотипический анализ in vitro, опираясь на мониторинг вторжения Mtb и умножения в клетки-хозяина с помощью автоматизированной конфокальные микроскопиифлуоресценции 3. Адаптация анализа в 384-хорошо микротитр пластин в сочетании с автоматизированным приобретением изображений и анализа, позволило высокого содержания / высокой пропускной способности скрининга (HC / HTS) средних библиотек соединений, siRNAs и бактериальных мутантов. Таким образом, скрининг широкой библиотеки РНК генома на этом фенотипической анализе позволил выяснению ключевых факторов, связанных с торговлей Mtb и внутриклеточной репликацией, а также выяснение путей хозяина, эксплуатируемых бактериорной бациллой. Еще одна адаптация этого конкретного фенотипического анализа была для выявления бактериальных факторов, необходимых для Mtb внутрифагосомальной настойчивости. Например, арест фагосомного созревания рассматривается как один из основных механизмов, который облегчает выживание и репликацию Mtb в макрофаге. Мониторинг субклеточной локализации вырубающих мутантов Mtb в флуоресцентно помеченных кислотных отсеках позволил выясовывания бактериальных генов, участвующих в процессевыживания 4. Наконец, высокосодержимая визуализация Mtb также предлагает отличный метод количественной оценки эффективности препарата для ингибирования различных явлений, таких как внутриклеточный ростбактерий 3. В целом, этот тип высокой пропускной способности фенотипического анализа позволяет ускорить открытие препарата против туберкулеза и данные, собранные этими различными подходами способствуют лучшему пониманию хозяина манипуляции, оказываемой Mtb.

Protocol

1. Высокой пропускной способностью генома всей siRNA скрининга Скрининг проводится в человеке Тип-II пневмоцитов модели A549 клеточной линии при инфекции СМТБ H37Rv выражая зеленый флуоресцентный белок (GFP). Эта процедура изложена на рисунке 1A. Resuspend высушенной биб?…

Representative Results

Скрининг siRNA по всему геному с высокой пропускной способностью Mtb способен колонизировать иммунные клетки в пробирке, а также несколько других клеток эпителия легких. Например, Mtbспособен инфицировать и повредить эпителиальные клетки A549, которые обычно испо…

Discussion

Мы описываем здесь методы, необходимые для фенотипического анализа с помощью GFP-экспрессинг Mtb H37Rv штамм заразить флуоресцентно помечены клетки-хозяина, что делает его подходящим для высокого содержания / высокой пропускной способности экранов. Этот протокол может быть применен к …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Финансовую поддержку этой работе оказали Европейское сообщество (ERC-STG INTRACELLTB Grant n’ 260901, MM4TB Grant n’ 260872), Национальное агентство Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) и регион Норд Па-де-Кале. Мы с благодарностью признаем техническую помощь Гаспара Делойсона, Элизабет Веркмайстер, Антонино Бонджованни и Фрэнка Лафонта с платформы BICeL.

Materials

µclear-plate black, 384 well Greiner bio-one 781091 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated
CellCarrier 384 well plate PerkinElmer 6007550 Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated
V-bottom white , 384 well-plate Greiner bio-one 781280
sealing tape, breathable, sterile Corning 3345
Lipofectamine RNAiMax Life Technologies 13778150 Transfection reagent
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 34943
RPMI 1640 + GlutaMAX-I Life Technologies 61870-010 Cell culture medium
D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 Life Technologies 14190-094 Dulbecco's Phosphate Salin Buffer
D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 Life Technologies 14190-091 Dulbecco's Phosphate Salin Buffer
Fetal bovine serum Life Technologies 2610040-79
FICOLL PAQUE PLUS DUTSCHER 17-1440-03 Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification
CD14 MicroBeads, human Miltenyi 130-050-201 Purification of CD14+ Monocytes
Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) Miltenyi 130-096-493 Macrophage Colony Stimulating Factor
LS Columns Miltenyi 130-042-401 Columns for CD14+ Monocytes isolation
Tween 80 Euromedex 2002-A Mycobacteria culture
Glycerol high purity Euromedex 50405-EX Mycobacteria culture
Middlebrook OADC enrichment Becton-Dickinson 211886 Mycobacteria culture
7H9 Becton-Dickinson W1701P Mycobacteria culture
Versene 1X Life Technologies 15040033 Non enzymatic cell dissociation solution
DAPI Life Technologies D1306 Nuclei dye
Hoechst 33342 Life Technologies H3570 Nuclei dye
Syto60 Life Technologies S11342 Nuclei/cytoplasm dye
Formalin Sigma-Aldrich HT5014 Cell fixation solution
siRNA targeting Dectin-1 Santa-Cruz sc-63276
*siGenome* Non targeted siRNA pool Dharmacon D-001206-14
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501 antibiotic
Isoniazid (INH) Sigma-Aldrich I3377-50G antibiotic
Hygromycin B Life Technologies 10687-010 antibiotic
Amikacin Sigma-Aldrich A1774 antibiotic
Automated Confocal Microscope OPERA PerkinElmer Image acquisition
Columbus 2.3.1 Server Database PerkinElmer Data transfert, storage and analysis
Acapella 2.6 software PerkinElmer Image-based analysis
GraphPad Prism5 software GraphPad Statistical analysis
Excel 2010 Microsoft Statistical analysis

Referencias

  1. Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
  2. Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
  3. Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
  4. Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
  5. Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
  6. Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
  7. McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
  8. Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  10. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
  12. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
  13. Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).

Play Video

Citar este artículo
Queval, C. J., Song, O., Delorme, V., Iantomasi, R., Veyron-Churlet, R., Deboosère, N., Landry, V., Baulard, A., Brodin, P. A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening. J. Vis. Exp. (83), e51114, doi:10.3791/51114 (2014).

View Video