Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием
Summary
Здесь мы описываем фенотипическое анализ, применимый к высокой пропускной способности / высокое содержание экранов малых помех синтетической РНК (siRNA), химическое соединение, и Mycobacterium туберкулеза мутант библиотек. Этот метод опирается на обнаружение флуоресцентно помечены Mycobacterium туберкулеза в флуоресцентно помечены клетки-хозяина с использованием автоматизированной конфокальные микроскопии.
Abstract
Несмотря на наличие терапии и вакцины, туберкулез (ТБ) остается одной из самых смертоносных и распространенных бактериальных инфекций в мире. На протяжении нескольких десятилетий внезапный всплеск штаммов с множественной и широко лекарственной устойчивостью представляет собой серьезную угрозу для борьбы с туберкулезом. Поэтому необходимо определить новые целевые показатели и пути, критически важные для причинного агента туберкулеза, микобактерий туберкулеза(МТБ),и найти новые химические вещества, которые могут стать противотуберкулезными препаратами. Один из подходов заключается в разработке методов, подходящих для генетических и химических экранов крупномасштабных библиотек, позволяющих искать иголку в стоге сена. С этой целью мы разработали фенотипический анализ, опираясь на обнаружение флуоресцентно помечены Mtb в флуоресцентно помечены принимающих клеток с использованием автоматизированной конфокалипической микроскопии. Этот анализ in vitro позволяет количественно оценить процесс колонизации Mtb в хост и был оптимизирован для формата микроплюса 384-ну, который является правильным для экранов siRNA-, химического соединения- или Mtb мутант-библиотек. Изображения затем обрабатываются для мультипараметрического анализа, который обеспечивает считыв вывод о патогенеза Mtb в клетках-хозяинах.
Introduction
Среди новых и вновь возникающих инфекционных патогенов, зарегистрированных в последние годы, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) занимает видное место, отвечая за 1,4 миллиона смертей и 8,7 миллиона новых инфекций в 2011 году (Глобальный доклад о туберкулезе 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Несмотря на наличие мультимедикаментозной терапии, число инфицированных людей по-прежнему растет, и мультимедикаментозная устойчивость (МЛУ), а также широко устойчивый к лекарственным средствам (XDR) Mtb быстро распространяется по всемумиру 1. Кроме того, принимая во внимание наличие Mtb антигенов, очевидно, что одна треть мирового населения считается скрыто инфицированных Mtb. Статистически, в одном случае из десяти, есть эволюция к активной форме заболевания с последующими клиническими симптомами2. Поэтому срочно нужны новые средства борьбы с МТБ. В этом контексте мы разработали визуальный фенотипический анализ in vitro, опираясь на мониторинг вторжения Mtb и умножения в клетки-хозяина с помощью автоматизированной конфокальные микроскопиифлуоресценции 3. Адаптация анализа в 384-хорошо микротитр пластин в сочетании с автоматизированным приобретением изображений и анализа, позволило высокого содержания / высокой пропускной способности скрининга (HC / HTS) средних библиотек соединений, siRNAs и бактериальных мутантов. Таким образом, скрининг широкой библиотеки РНК генома на этом фенотипической анализе позволил выяснению ключевых факторов, связанных с торговлей Mtb и внутриклеточной репликацией, а также выяснение путей хозяина, эксплуатируемых бактериорной бациллой. Еще одна адаптация этого конкретного фенотипического анализа была для выявления бактериальных факторов, необходимых для Mtb внутрифагосомальной настойчивости. Например, арест фагосомного созревания рассматривается как один из основных механизмов, который облегчает выживание и репликацию Mtb в макрофаге. Мониторинг субклеточной локализации вырубающих мутантов Mtb в флуоресцентно помеченных кислотных отсеках позволил выясовывания бактериальных генов, участвующих в процессевыживания 4. Наконец, высокосодержимая визуализация Mtb также предлагает отличный метод количественной оценки эффективности препарата для ингибирования различных явлений, таких как внутриклеточный ростбактерий 3. В целом, этот тип высокой пропускной способности фенотипического анализа позволяет ускорить открытие препарата против туберкулеза и данные, собранные этими различными подходами способствуют лучшему пониманию хозяина манипуляции, оказываемой Mtb.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем здесь методы, необходимые для фенотипического анализа с помощью GFP-экспрессинг Mtb H37Rv штамм заразить флуоресцентно помечены клетки-хозяина, что делает его подходящим для высокого содержания / высокой пропускной способности экранов. Этот протокол может быть применен к …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансовую поддержку этой работе оказали Европейское сообщество (ERC-STG INTRACELLTB Grant n’ 260901, MM4TB Grant n’ 260872), Национальное агентство Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) и регион Норд Па-де-Кале. Мы с благодарностью признаем техническую помощь Гаспара Делойсона, Элизабет Веркмайстер, Антонино Бонджованни и Фрэнка Лафонта с платформы BICeL.
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
Referencias
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
