Summary

Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em> Burkholderia</em> Espèces

Published: October 15, 2013
doi:

Summary

Les membres du genre Burkholderia sont des agents pathogènes d'importance clinique. Nous décrivons un procédé pour l'extraction totale de la protéine bactérienne, en utilisant une rupture mécanique, et un gel d'électrophorèse 2D pour l'analyse protéomique ultérieure.

Abstract

L'enquête sur les niveaux de protéines intracellulaires d'espèces bactériennes est importante pour la compréhension des mécanismes pathogènes de maladies causées par ces organismes. Nous décrivons ici un procédé pour l'extraction des protéines à partir de Burkholderia espèces sur la base de la lyse mécanique à l'aide de billes de verre en présence d'acide éthylène-diamine tétra-acétique et de fluorure de phénylméthylsulfonyle dans du tampon phosphate salin. Cette méthode peut être utilisée pour différentes espèces Burkholderia, pour différentes conditions de croissance, et il est probable adapté pour l'utilisation dans des études de protéomique d'autres bactéries. Après l'extraction de la protéine, un (2-D) électrophorèse sur gel technique protéomique deux dimensions est décrit pour étudier les changements mondiaux dans les protéomes de ces organismes. Cette méthode consiste en la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans la première dimension, suivie d'une séparation sur la base du poids moléculairepar électrophorèse sur gel d'acrylamide dans la seconde dimension. Visualisation de protéines séparées est effectuée par coloration à l'argent.

Introduction

Le genre Burkholderia comprend plus de 62 espèces, organismes Gram négatifs isolés à partir d'une large gamme de niches, et elle est divisée en deux groupes principaux 1,2. Le premier groupe comprend des organismes phytotrophique humaine, animale et, et la plupart des études ont porté sur les espèces pathogènes de ce groupe en raison de leur importance clinique. Les membres les plus pathogènes sont B. pseudomallei et B. mallei (qui provoque melioidosis et morve respectivement) 3,4 et pathogènes opportunistes (les 17 espèces déterminées du complexe Burkholderia cepacia, BCC) 5, qui causent la maladie de la fibrose kystique (FK) et granulomatose chronique (CGD) 1. Le deuxième groupe, avec plus de 30 espèces non pathogènes, comprend bactéries associées aux plantes ou à l'environnement, et sont considérés comme potentiellement bénéfique à l'hôte 2.

De nombreuses complications surgissent frinfection bactérienne om avec les éléments pathogènes du genre Burkholderia, tels que la transmission de l'agent pathogène entre les patients, la propagation de la maladie et l'échec du traitement en raison de la résistance intrinsèque ou acquise aux antibiotiques rend difficile à éliminer dans la plupart des cas, de 6 à 9. Par conséquent, acquérir une meilleure compréhension de la base pour l'établissement d'une infection bactérienne est essentiel pour le traitement des maladies causées par ces organismes. Afin de mieux comprendre la mise en place de l'infection, des enquêtes approfondies sur les composants bactériens associés à la pathogenèse sont nécessaires. Les études portant sur ​​l'analyse protéomique des organismes Burkholderia utilisant une approche protéomique décrits protéines qui ont été impliqués dans la pathogenèse bactérienne ainsi que des changements dans leur protéome Profils avec 10-16.

méthodes d'extraction des protéines à l'aide de sonication et les cycles de gel-décongelés dans un tampon de lyse contenant une grande concentration de l'urée, de la thio-urée en combinaison avec un détergent et ampholytes a été appliquée dans des études protéomiques Burkholderia 10-13. Bien que l'urée est tout à fait efficace pour la dénaturation des protéines, on peut établir un équilibre en solution aqueuse avec de l'isocyanate d'ammonium, qui peut réagir avec les groupes d'acides aminés, en formant ainsi des artefacts (réaction de carbamylation) 17. Par conséquent, il est recommandé d'inclure des ampholytes porteurs, qui agissent comme piégeurs de cyanate et d'éviter des températures supérieures à 37 ° C 17. En outre, pour éviter toute interférence chimique de tampon de lyse avec de la protéine quantification, le même tampon de lyse peut être utilisé pour générer la courbe d'étalonnage de telle sorte que les échantillons et les standards ont le même fond 10. D'autres méthodes impliquent l'utilisation de tampons et détergents alcalins avec des périodes d'incubation de chaleur 17,18, mais ces conditions pourraient induire des changements dans le protéome et certains détergents sont pas compatibles avec proteomics demande si des mesures ultérieures d'élimination de détergent sont inclus 17,18.

Après l'extraction et la quantification adéquate, expression de la protéine globale de chaque protéine individuelle peut être étudiée en utilisant des approches protéomiques telles que deux dimensions (2-D) électrophorèse sur gel. Cette technique a été décrite par O'Farell 19 et consiste en la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans la première dimension, et ensuite en fonction de leur poids moléculaire par électrophorèse sur gel d'acrylamide dans la seconde dimension. En raison de sa sensibilité et de résolution, cette technique est un outil puissant pour l'analyse et la détection des protéines provenant de sources biologiques complexes 19,20. Cette technique de séparation est actuellement disponible dans les approches de protéines centrée avec le grand avantage de résoudre isoformes de protéines causées par des modifications post-transcriptionnelles ou traitement protéolytique. Les changements quantitatifspeut être détectée en comparant l'intensité de la tache correspondant après coloration du gel 20. Cependant, cette technique n'est pas adaptée pour l'identification de très grosses protéines, des protéines membranaires, des protéines extrêmement acides ou basiques et hydrophobes, et est une technique assez laborieux et prend du temps 20. De nouvelles approches de peptides centrée (à base de gel non) qui sont plus robustes et objective deviennent disponibles et peuvent être utilisés pour la comparaison quantitative par des méthodes stable de marquage isotopique différentielles telles que l'étiquetage de la cystéine par affinité isotope codé marquage (ICAT) 21, et un groupe amino étiquetage par isotopes marquage pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) 22. L'utilisation d'une technique de protéomique unique pourrait donner des informations insuffisantes, par conséquent l'utilisation de deux approches protéomiques complémentaires est nécessaire pour la plupart des changements évaluer pleinement dans protéome. Néanmoins, l'électrophorèse sur gel 2-D est largement utilisé et peut être appliquée de façon routinière pour la quanquantitatif expression de plusieurs protéines dans des organismes différents.

Nous décrivons ici une extraction de protéines à cellules entières et les procédures d'électrophorèse sur gel 2-D pour les espèces de Burkholderia qui ont été adaptés et optimisés à partir des 2-D Principes électrophorèse GE Healthcare et méthodes Manuel 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). L'extraction de la protéine a été effectuée en utilisant un batteur de billes avec des billes de verre en présence de PBS contenant 5 mM d'EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique) et 1 mM de PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle). Cette procédure permet la quantification des protéines avec une dégradation minimale et est modifiable pour les approches protéomiques Comme indiqué précédemment 15,23,24. Électrophorèse sur gel 2-D a été effectuée en utilisant 24 cm de long immobilisées pH 4-7 gradient et les protéines ont été séparées en fonction de leur point isoélectrique. Ensuite, les protéines ont été séparées en fonction de leur Molecpoids culier par gel SDS-polyacrylamide. De plus, nous avons décrit un procédé de coloration à l'argent pour la visualisation des protéines d'accompagnement, et un procédé de coloration à l'argent qui est compatible pour l'analyse par spectrométrie de masse. Ensemble, ces procédures peuvent permettre l'identification de protéines importantes d'espèces Burkholderia qui pourraient être impliqués dans la pathogenèse.

Protocol

Une. La croissance de la culture (Jours 1 +2) Cultiver une culture de départ: 3 ml de Luria Bertani (LB) dans un tube pression supérieure de 15 ml, à 37 ° C pendant la nuit de la coiffe. Diluer la croissance durant la nuit jusqu'à une DO 600 de 0,6. Ajouter 1 ml de cette dilution à 100 ml de bouillon LB dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml. Incuber à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute pendant 16 heures en phase stationnaire (SP), pour mieux approximatif, en culture par lot, le…

Representative Results

L'analyse comparative des profils protéiques extraites de la même culture bactérienne à deux reprises a montré des tendances similaires bandes indiquant les extractions de protéines succès. Protéines de poids moléculaire extraits variaient de 10 à 150 kDa. Montre la figure 1 représentant de Coomassie gel de coloration bleue des extractions de protéines à cellules entières de multivorans Burkholderia (un membre de la BCC) isolats cliniques cultivées en LB ou levure / Manitol (…

Discussion

Procédé de préparation de protéines a été décrite qui peut extraire la majorité des protéines Burkholderia avec une bonne reproductibilité. Ceci est démontré par l'obtention du même profil de protéine à partir de deux préparations indépendantes réalisées en différents jours en utilisant la même culture bactérienne cultivée dans un bouillon LB ou de YEM comme représenté sur la figure 1. Extraction était efficace pour les bactéries cultivées dans un milieu liquide,…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une bourse de l'Université de la Colombie-Britannique (à BV) et des subventions de Fibrose kystique Canada et du Canada Instituts de recherche en santé (DPS) à. Nous remercions Jacqueline Chung pour la préparation initiale de protocoles.

Materials

Reagents
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
Acetone Fisher A18-1 Flammable
PBS Buffer Bioscience R028
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
Agarose Invitrogen 15510-027
Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
Sodium acetate EM Science 7510
Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
Sodium thiosulfate Sigma S7026
Tris Base EMD 9230
Glycine MPBiomedical, LCC 808831
Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
Mineral oil ACROS 415080010
Equipment
JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

Referencias

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Velapatiño, B., Zlosnik, J. E. A., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

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