총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한<em> Burkholderia의</em> 종
Summary
Burkholderia의 속의 구성원은 임상 중요성 병원균이다. 우리는 기계적 중단하고 후속 단백질체 분석에 2-D 겔 전기 영동을 사용하여, 전체 박테리아 단백질을 추출하는 방법을 설명한다.
Abstract
세균 종의 세포 내 단백질 수준의 조사가 이들 유기체에 기인 한 질병의 발병 기전을 이해하는 데 중요하다. 여기에서 우리는 인산염 완충 생리 식염수에 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 및 페닐 메틸 불소의 존재에 유리 구슬을 사용하여 기계적인 용해에 따라 부르크 홀데 리아 종에서 단백질을 추출하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 다른 성장 조건을 위해, 다른 부르크 홀데 종에 사용될 수 있고, 다른 균의 프로테오믹스 연구에 사용하기위한 것으로 적당하다. 단백질 추출 후, 이차원 (2-D) 겔 전기 단백체 기술은 이러한 유기체의 프로테옴에서 해외 변화를 연구하는 기술된다. 이 방법은 분자량에 기초하여 분액하여 제 차원에서 등전위 포커싱에 의해 그들의 등전점에 따라 단백질의 분리, 이루어져두 번째 차원에서 아크릴 아마이드 겔 전기 영동에 의해. 분리 된 단백질의 시각화를 실버 염색으로 수행된다.
Introduction
속 부르크 홀데 이상의 62 종, 틈새의 넓은 범위로부터 분리 그람 음성균를 포함하고, 그것은 두 가지 주요 클러스터 1,2에서 분할된다. 첫번째 클러스터는 인간, 동물 및 phytotrophic 유기체를 포함하고, 대부분의 연구는 그들의 임상 적 중요성이 그룹의 병원성 종에 초점을 맞추고있다. 대부분의 병원성 회원 B.합니다 의 pseudomallei와 B. (각각 melioidosis 및 저병의 원인이됩니다) mallei 3,4 및 낭포 성 섬유증 (CF) 및 만성 육아 종성 질환 (CGD)에 질병을 일으키는 원인이 기회 병원균 5 (Burkholderia의의 세파 시아 단지, BCC의 정의 17 종), 1. 이상의 30 비병원성 종 번째 클러스터는, 식물 또는 환경과 연관된 박테리아를 포함하고, 호스트 (2)에 대한 잠재적으로 유리한 것으로 간주된다.
많은 합병증은 FR 등장이러한 이유로 인해 경우 6-9 대부분의 근절하기 위해 열심히하는 항생제에 내장 함수 나 인수 저항의 환자, 질병의 확산 및 치료 실패의 병원체의 전송로 Burkholderia의 속의 병원성 멤버와 톰 세균 감염. 따라서 세균 감염의 설립을위한 기준의 명확한 이해를 얻는 것은 이러한 생물에 의한 질병의 치료에 매우 중요합니다. 감염의 확립에 대한 통찰력을 얻기 위해, 병인과 관련된 세균 성분에 대한 광범위한 연구가 필요하다. 프로테오믹스 방법을 사용 부르크 홀데 유기체의 프로테옴 분석에 집중 연구는 세균성 병인에 연루뿐만 아니라 프로테옴 변화가 10-16 프로파일 된 단백질을 설명했다.
높은 진한 함유 용해 버퍼에서 초음파 처리 및 동결 해동 사이클을 이용한 단백질 추출 방법요소의 entration, 세제 및 양쪽 성과 함께 티오는 Burkholderia의 프로테오믹스 연구 10-13에 적용되었습니다. 우레아는 단백질 변성에 대해 매우 효율적이지만, 그것에 의해 (의해 carbamylation 반응) 아티팩트 (17)를 형성하는 아미노산 그룹과 반응 할 수있는 암모늄 이소시아네이트와 수용액 평형을 확립 할 수있다. 따라서, 시안의 청소부 역할을 캐리어 양쪽 성을 포함, 37 ° C 17 이상의 온도를하지 않는 것이 좋습니다. 또한, 단백질 정량화 함께 용해 완충액의 화학적 간섭을 방지하기 위해, 동일 용해 완충액은 샘플 및 표준이 동일한 배경 (10)를 가질 수 있도록 표준 곡선을 생성하는데 사용될 수있다. 다른 방법은 열 배양 기간 (17, 18)와 알칼리 버퍼와 세제의 사용을 포함하지만 이러한 조건은 프로테옴의 변화를 유도 할 수 있으며 일부 세제 홍보와 호환되지 않습니다oteomics 출원은 후속 세제 제거 단계 (17, 18)를 포함하지 않는 경우.
적절한 추출 및 정량 한 결과, 각각의 단백질의 해외 단백질 발현은 이차원 (2-D) 겔 전기 영동 등 프로테오믹스 방법을 사용하여 조사 할 수있다. 이 기술은 제 O'Farell 19에 의해 설명되고 제 차원에서 아크릴 아마이드 겔 전기 영동에 의해 제 차원에서 등전위 포커싱에 의해 그들의 등전점에 따라 단백질을 분리 한 다음 그 분자량에 따른 것으로 구성 하였다. 그것의 해상도와 감도로,이 기술은 복잡한 생물학적 소스 (19, 20)에서 단백질의 분석 및 검출을위한 강력한 도구입니다. 이 분리 기술은 전사 후 수정이나 단백질 분해 처리에 의한 단백질 이소 해결의 큰 장점과 단백질 중심의 접근 방식에서 현재 사용할 수 있습니다. 양 변경겔 (20)의 염색 후에 해당 스팟의 강도를 비교함으로써 검출 될 수있다. 그러나,이 기술은 매우 큰 단백질, 막 단백질, 매우 염기성 및 산성 또는 소수성 단백질의 식별에 적합하고, 다소 힘들고 시간 소모적 기법 20 아니다. 보다 강력하고 객관적 새로운 펩타이드 중심의 접근 방식 (비 젤 기준) 사용할 수있게하고 (ICAT) 21에 태그를 동위 원소 코드 친화력에 의해 시스테인 라벨 및 아미노기로 차등 안정 동위 원소 표지 방법으로 정량적 비교를 위해 사용될 수있다 상대 및 절대 정량 (iTRAQ) 22 동위 원소의 태그에 의해 표시. 하나의 프로테오믹스 기술의 사용은 충분한 정보를 줄 수도 있으므로 두 개의 보완적인 단백질 체학 접근 방법의 사용은 프로테옴에서 가장 완벽하게 평가하는 변화가 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 2-D 겔 전기 널리 사용되며 일상적 콴 적용될 수있다다른 생물의 여러 단백질의 발현을 titative.
여기에 우리가 적응하고 최적화 된 GE 헬스 케어 2-D 전기 원리 및 방법 핸드북 80-6429-60AC 2004 (한 부르크 홀데 리아 종에 대한 전체 세포 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 절차에 대해 설명 www.amershambiosciences.com )를. 단백질 추출은 5 mM의 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 및 1mM의 PMSF (페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드)를 함유하는 PBS의 존재하에 유리 비드와 비드 비터를 사용하여 실시 하였다. 이 절차는 최소한의 분해와 단백질의 정량화를 허용하고 이전에보고 15,23,24 등 프로테오믹스 방법에 대한 수정할 수있는 것입니다. 2-D 겔 전기 영동은 24 ㎝ 길이 고정화 pH를 4-7 구배 및 단백질을 사용하여 수행된다 그들의 등전점에 따라 분리 하였다. 그런 단백질은 자신의 molec에 따라 분리SDS-폴리 아크릴 아마이드 젤에 의해 신경근 무게. 또한, 우리는 자리 단백질의 시각화 및 질량 분석기 분석을위한 호환 실버 얼룩 방법을은 염색 방법을 설명했다. 함께 이러한 절차는 병인에 관여 할 수 부르크 홀데 리아 종에서 중요한 단백질의 식별을 허용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단백질의 제조 방법은 재현성 좋게 부르크 홀데 단백질의 대부분을 추출 할 수있는 것을 설명 하였다. 이는 그림 1과 같이 LB 또는 YEM 배양액에서 성장 같은 세균 배양을 사용하여 다른 일을 수행 두 개의 독립적 인 준비에서 같은 단백질 프로파일을 획득하여 보여줍니다. 그러나 우리가 접시에 성장 세균이 방법을 시험하지 않았다; 추출 액체 배지에서 자란 박테리아 효율적이?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (BV에) 브리티시 컬럼비아 대학에서 재학하고 (DPS에) 건강 연구의 낭포 성 섬유증 캐나다와 캐나다 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 프로토콜의 초기 준비를 위해 재클린 정 감사합니다.
Materials
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
Referencias
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