Domates / GFP-FLP / FRT yöntem Drosophila canlı mozaik fotoreseptör hücreleri görselleştirme içerir. Bu, gün veya hafta içinde retinada fotoreseptör hücre tek kaderlerini takip etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, retinal dejenerasyonu ve nörodejeneratif hastalıklar, fotoreseptör hücre geliştirme çalışmaları için idealdir.
Drosophila göz çok geliştirme ve nöronal dejenerasyonun çalışmalar için bir model olarak kullanılır. Güçlü bir mitotik rekombinasyon tekniği ile, klon analizine dayalı zarif bir genetik ekranları göz gelişimi ve larva aşamalarında fotoreseptör (PR) farklılaşma dahil sinyal yollarının tanımlanmasına yol açmıştır. Burada yetişkin Drosophila yaşayan gözünde hızlı klonal analizi için kullanılabilir Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi tarif etmektedir. Floresan fotoreseptör hücreleri flipase aracılı rekombinasyon tarafından oluşturulan mozaik klonları ile retina üzerinde, kornea nötrleştirme tekniği ile görüntülü. Bu yöntem, retina klasik histolojik kısımlara göre büyük avantajlara sahiptir: yüksek miktarda madde taraması için kullanılabilir ve PR hayatta kalmasını ve fonksiyonunu düzenleyen faktörlerinin tanımlanması için etkili bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Aynı oturma Deriden PR dejenerasyon kinetik analizi için kullanılabilirdiğerleri birkaç hafta içinde, yetişkin sinek PR hayatta kalma ya da fonksiyon için spesifik genler için gereksinimi göstermek için. Bu yöntem, aynı zamanda düzlemsel bir hücre polarite kurulması etkilenir edildiği gibi gelişimsel mutantlar, hücre özerklik sorunları ele almak için yararlıdır.
Drosophila retina polarite açık bir şekilde tanımlanmış bir eksen (Şekil 1 B) ile tam olarak düzenlenir yaklaşık 800 ommatidial birimi (Şekil 1A), oluşmaktadır. Sekiz fotoreseptör hücreleri (PR) ve koni hücreler, pigment hücreleri ve hücreler 1,2 kıl dahil 12 aksesuar hücreleri: Her ünite 20 hücreleri içerir. PR iki sınıflarının ifade rodopsin türüne (Rh) temelinde ayırt edilir. Altı dış PR (R1-6) RH1 ifade etmek ve bir trapezoid desen (Şekil 1C) düzenlenmiştir. Yamuk merkezinde, iki iç PRs (R7/R8) rodopsin dört olası türleri (RH3, RH4, RH5 veya RH6) ifade ve R7 R8 3 üstüne yatıyor şekilde düzenlenmektedir.
2500'den fazla genler de dahil olmak üzere, göz deve süreçlerinin geniş bir paneli, çalışmaları için çok güçlü bir modeli olduğunu kanıtlamıştır Drosophila göz 4, morfogenezindeki katılıyormizde, PR işe alım, farklılaşma, düzlemsel hücre polarite, morfogenez, hayatta kalma, apoptoz ve görsel iletimi 5-9.
Drosophila göz üzerinde çalışan araştırmacılar, uzun yıllar boyunca, retina görüntüleme ve sistematik genetik ekranları yürütülmesi için teknikler geliştirdik. Görüntünün en kolay yolu, yetişkin retina hareketsizleştirilmiş bir hayvan (Şekil 1A) korneanın bakmaktır. Korneanın yapı taramalı elektron mikroskobu ile tam olarak görselleştirilebilir ve URCFG konsorsiyum tarafından büyük çaplı bir genetik ekran kullanılmıştır ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Bu genellikle gelişme ya da hücre canlılığı erken adımları kontrol eden genlerin mutasyon tarafından uyarılan bu tür göz pürüzler veya parlaklık gibi kornea yapısında küresel morfolojik değişiklikler, görselleştirmek için çok etkili bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, kornea genel görüntüleme su değilPR rhabdomere morfonogenezi veya yetişkin PR canlılığını ve işlevini düzenleyen faktörleri belirlemek için fficient. Bu tür analizler retina 11-13 teğet yarı-ince reçine kesitlerin faz-kontrast mikroskobu dayalı PR bütünlüğü daha kapsamlı bir soruşturma gerektirir. Bu teknik, mutant PR kırmızı pigment 14,15 onların eksikliği tarafından tespit edilebileceği mozaik analizler için uygundur.
Mozaik mutant klonlar da floresan mikroskobu 16,17 yeşil floresan proteininin (GFP) sinyal onların eksikliği temelinde, pupa veya ergin retinanın tüm montaj disseksiyonlarında görülebilir. Bu iki teknik, çok kullanışlıdır, ancak her ikisi de emek ve zaman alıcıdır ve bu nedenle de büyük ölçekli tarama için uygun değildir. Biz ve diğerleri hızlı PR analizleri kolaylaştırmak için, floresan proteinleri 18,19 üreten PRs ve görüntüleme için kornea nötralizasyon tekniklerinin kullanımını geliştirdik. Bu teknik, mutant ileklon mozaik yetişkin Drosophila klonlarda kırmızı (+ a) pigment otoflüoresanla temelinde tespit edilebilir. Ancak, bu yöntem hücre özerklik gidermek için gerekli olan tek hücreli bir çözünürlük 19 verir sağlamaz. Biz mitotik rekombinasyon 20 ile kornea nötralize edilerek floresan proteinlerin görüntüleme birleştiren Domates / GFP-FLP / FRT yöntemini geliştirerek bu sorunun üstesinden geldi. Bu yöntem, tek hücreli çözünürlükte, yüksek verim, mozaik klonlar mutant PRs hızlı ve net bir şekilde tanımlanmasını, (sağlar http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Bu Drosophila yaşayan haftalık bir süre boyunca tek PRs aşağıdaki için, kinetik analizlerde kullanım için uygundur. Biz mozaik gözleri basit, kinetik analizlerde kullanımı için burada Domates / GFP-FLP / FRT yöntem ve ipuçlarını anlatabilir.
Drosophila göz yaygın olarak geliştirilmesi, proliferasyonu ve hayatta kalma düzenleyen sinyal yolları deşifre etmek için kullanılmıştır. 1990'ların başında, genetik ekranlar çok sayıda PR gelişme 25-27 başlangıç aşamalarında gerekli yolları belirlemek için yapılmıştır. Genetik ekranlar verimliliği mümkün mozaik klonlar 21 kayıp fonksiyon-mutasyon test yapar mitotik rekombinasyon tekniği ile büyük ölçüde artmıştır. Bu nedenle, embriyonik öldürücü mutasyonların rolü sistematik olarak, aksi heterozigot sinekler gözünde homozigoz mutant klonlar test edilebilir. Çoğu mozaik gösterimleri erken PR işe alım, farklılaşma, aksonal projeksiyon ya da gelişmekte olan larva veya pupa 10,25-31 meydana gelen morfolojilerinden odaklanmıştır. Bugüne kadar, sadece tek bir mozaik ekran electroretin aracılığıyla görsel tepkisini izleyerek, yetişkin PR işlevi düzenleyen mekanizmaları araştırılmıştırPROGRAM ÇA Ğ RISI 32 Kayıtlar. Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi ve mutant hayvanlar yaşayan zamanlı ders analizi gerçekleştirme imkanı ile, biz yetişkin PR canlılığını düzenleyen faktörlerin belirlenmesi için yeni bir yöntem tasarlanmış ve 20,24 işlev var.
Domates / GFP-FLP / FRT yöntemi reçine-gömülü gözleri klasik histolojik kesit üzerinde birçok önemli avantajı vardır. İlk olarak, bu yöntem çok daha hızlı, ucuz ve histolojik yöntemi gerçekleştirmek için daha kolay, uygun bir suda daldırma objektif ile donatılmış bir fluoresans mikroskopu (Reaktifler ve Teçhizat Tablo) kullanılabilir sağlanmıştır. İkinci olarak, domates / GFP-FLP / FRT yöntem mini beyaz bir transgeni taşıyan, örneğin (W + UAS,) P ifadesi olarak, transgen ekspresyonu ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Domates / GFP-FLP / FRT sistemi, P w + klonal saptanması için kullanıldığı histolojik bölümlerde, aksine (UAS, W +) klonal d müdahale etmezDomates floresan protein göre etection. P Kullanma (UAS-fatp, + w) transgenik sinekler, biz fatp mutant PRs kurtarılmasının (Şekil 7) görselleştirmek için başardık. Üçüncüsü, Domates / GFP-FLP / FRT dayalı, kayıp PRs genotipinin belirsizlik olduğunu da dahil olmak üzere klonal analiz her türlü, önemli bir hatadır. Gerçekten de, bir PR için spesifik bir gen fonksiyon eksikliği nedeniyle ya da özellikle de mutant klonu sınırında bir hücre otonom-olmayan, etkisinin mevcut olup olmadığı açık olabilir. Domates / GFP-FLP / FRT metodu, birkaç haftalık dönemler boyunca aynı hayvanda vahşi tip ve mutant PRs takip yaparak dejenerasyon bu soruna alır. Biz kinetik bireysel PRs kaderini farklı fatp mutant sinekler üzerinde analizler (Şekil 6) takip başardık. Aynı klon için çevredeki vahşi tip klonların tam şekli, farklı zamanlarda, belirli bir hayvanda tespit edilebilir. Biz kesin göstermek başardıkTüm eksik PRs PRs içinde fatp mutantların rolü hücre özerk olduğunu gösteren, fatp için mutant olduğunu ly. Bu durumda, bir kinetik analizi PR 'kaybını izleyerek, yetişkin başlangıçlı dejenerasyonu modellerinde PRs genotipini belirlemek mümkündür. Son olarak, domates / GFP-FLP / FRT yöntem PCP 20 kurulmasını düzenleyen faktörlerin tanımlanması için çok güçlü olduğu kanıtlanmıştır. Bölümler için gerek kalmadan bir kutup fenotipi için mozaik ommatidia çok sayıda puanlama olasılığı, PCP kurulması için PR ihtiyacının hızlı bir şekilde belirlenmesini kolaylaştırır. Bununla birlikte, PR bütünlüğü ince analiz faz kontrast veya elektronik mikroskop ardından geleneksel bölümlendirilmeleri gerektirir.
Sonuç olarak, Domates / GFP-FLP / FRT yöntem, vis gibi PR gelişimsel süreçlerini ve yetişkin PR fonksiyonlarını düzenleyen faktörleri belirlemek için verimli mozaik tarama için yeni olanaklar açarual tepki ve canlılığı.
The authors have nothing to disclose.
Fransa UMS3444 Biosciences, Lyon, ve PLATIM ve Droso-Tools tesisleri. Barlar ücretsiz araştırma Fondation hibe tarafından desteklenmiştir CNRS (ATIP) dan la Recherche Médicale dökün ve ANR-12-BSV1-0019-01'dir. PD Retina Fransa dernek ve Lyon Ecole Normale Supérieure (Fransa) tarafından desteklenmiştir. CL La Ligue Nationale contre le Kanser derneği tarafından desteklenmiştir.
Reagent | |||
Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
[HEADER] | |||
Equipment | |||
Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |