モザイク大人のライブイメージングのためのトマト/ GFP-FLP / FRT方法<em>ショウジョウバエ</em>視細胞

トマト/ GFP-FLP / FRT方法は、突然変異又はショウジョウバエ網膜内のPRの発達および生存における異所性発現の効果を研究するために使用することができる。最近では20を示されているように、スクリーニングの目的に最適です、迅速である。同じ目における野生型PRSは隣の変異体のPRの存在が、変異のPRに関連した欠陥を検出するために、細胞の自律性の問題に対処することが容易になります。 我々の分析で観察された発達障害は、PRの募集、形態形成および平面内細胞極性（PCP）の確立（ 図5）を含む、様々なプロセスに影響を与えた。 欠席セブン特に内側のPRのR7 1のために、PRの募集に必要です。インナーPRの損失および一部外側のPR（ 図5A）での不在の結果セブンの損失。 粒子の粗いヘッド（GRH）は 、PCPの確立に関与しているといくつかの個眼はINVですGRH変異体クローン（ 図5B）にerted。この方法は、遺伝子が正しいPCPの取得のために必要とされるのPRの識別を容易にする、モザイク個眼における変異体のPRを識別することが可能となる。我々は、GRHは、R3の前駆体20中のPCPを正しく取得するために必要であることを示している。確かに、我々は反転個眼では、R3の前駆体から異常に起因するR4は、常にミュータントだったことを観察した。パン粉（CRBSは）感桿分体の形態形成に必要な23頂端膜タンパク質である。不規則な、大きくても小さくてのPR（ 図5C）でのCRBS 11A22ミュータント結果CRBSの損失。 この方法はまた、成人期（ 図6）の間に単一のPRの運命を追跡するために使用することができる。ホモ接合変異体のPRのグループを見ることができ、同じグループが同じ目に記載されていますので、神経変性の研究に最適です数日から数週間の期間にわたって同じフライ。各クローンは、眼を蛍光顕微鏡の下に配置されたときに認識することができるユニークな形状を有しているので、死ぬ運命にある生き残るがどのPRを決定することが可能である。網膜が偏光されるように、その形状に基づいて、再度同じクローンを見つけるために、網膜を配向することができる。私たちは、FATP k10307変異が成人期における進行性のPR変性（ 図6、24） を誘導することを示すために、このメソッドを使用していました。この視覚化の方法はまた、細胞自律性を分析するために使用することができる。 FATP k10307モザイク網膜では、PRの損失は、野生型のPRが影響を受けない、変異体のPRをFATPに限定されていた。広報生存にFATPの要件は、細胞自律的である。またRH1-GAL4ドライバーとUAS-FATP構築物（ 図7）と野生型FATPを reexpressingによってFATP変異体のPRを救出することができました。ザ·例えば、レスキュー実験を実施する可能性は、樹脂包埋網膜の組織切片に基づいて、クローン解析を超えるトマト/ GFP-FLP / FRT方法の利点の一つである。 （+ W）ミニ白遺伝子に関連する赤い色素沈着が赤色顔料で目を覆っているのに対し、実際のところ、トマト/ GFP-FLP / FRT法によるクローンの検出は、P（UAS、W +）トランスジェニック構築物の使用に影響されない、組織切片にモザイククローンをマスキング。 図1。 ショウジョウバエの眼の組織。 （A）実体顕微鏡で撮影したショウジョウバエの眼の写真。 ショウジョウバエの眼は、約800個眼で構成されている。（B）は 、目の途中で64個眼の視野の模式図。各個眼の6外側の光受容ニューロン（PRS）、緑色で示され、目の最も近い極を指すステレオタイプ台形に整理されています。それらは、結果的に赤道と呼ばれる二つの部分間の境界に記載の鏡像を腹側と背側の眼の部分に反対方向に指している。個眼の（C）模式図。それぞれ個眼は8のPRが含まれています。緑色で示したR6のPRのR1は、外側のPRである。これらは、感光性分子rhodopsin1（体Rh1）を発現し、哺乳類の桿体細胞に相当します。インナーのPR、R7およびR8は、（R7はR8の上に座って）グレーで表示されています。内側のPRはロドプシン3、4、5または6を発現し、哺乳類の錐体細胞と同等である。簡単にするために、唯一感桿分体、PRの感光部分は、それぞれのPRのために示されている。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 <imgFO ALT =「図2」：コンテンツの幅= "4.25in" SRC = "/ files/ftp_upload/50610/50610fig2.jpg" /> 図2。生成とトマト/ GFP-FLP / FRT法でショウジョウバエの眼にモザイクPRクローンを可視化する。トマト/ GFP-FLP / FRT方法におけるモザイククローンの発生の（A）概略図。モザイクのクローンが原因の目の開発とFRT配列の間に（アイレスプロモーターの制御下）flipaseの発現に、有糸分裂組換えによって生成されます。 FRT配列および細胞分裂の組換え後に、ホモ接合変異体、ホモ接合性野生型およびヘテロ接合性細胞は、ヘテロ接合性細胞から生成することができる。これらの細胞は、大人の目の中のPRのモザイクのクローンを形成するために、再び分割します。変異細胞の同定は、野生型およびヘテロ接合性の細胞を標識するために、野生型の染色体に赤色蛍光タンパク質tdTomatoを発現する構築物を挿入することによって促進される。（B-B''）のtモザイクPRクローンの可視化彼トマト/ GFP-FLP / FRT方法。トマト/ GFP-FLP / FRT法が有糸分裂組換え、角膜中和し、共焦点顕微鏡を組み合わせたものです。すべてのPRは、角膜中和し、共焦点顕微鏡（B）を用いてのPRの可視化を容易にする緑色蛍光タンパク質GFPを発現する。 PRは、単一細胞レベルで可視化することができる。変異体モザイククローンは、有糸分裂組換えによって生成され、赤色蛍光タンパク質tdTomato（B '）の不存在によって同定することができる。野生型およびヘテロ接合のPRが（B''）を黄色であるのに対し、その結果、マージされた画像に、ホモ接合PRSは、緑色で表示されます。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図3。 visualizatためのショウジョウバエの設定角膜中和によるイオン。アガロースで満たされたプレート上に固定化されたショウジョウバエの（-A''''）写真。パネルA''''では、ハエを含むアガロース片は、プロファイルの写真を取るためにカットされています。 ショウジョウバエは、アガロース内右翼、アガロース表面に付着した左翼（A、A''、''''）で、アガロース中に半埋め込 ​​まれています。 ショウジョウバエアガロースに埋め込 ​​まれている場合、その頭部は、しばしば不十分な眼（A、A '）を可視化するために配置される。ヘッドは、したがって、アイの中央には、（A''、A'' '）上を向いているようにピンセットでreorientatedされなければならない。（B-B'） ショウジョウバエを示す模式図では、アガロースプレートの位置に固定化された顕微鏡の対物の下でショウジョウバエを舞台に、ショウジョウバエの設定。（C-C '）写真その目的の下に顕微鏡。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図4。経時的分析のための目の向き。図は概略図として表現角膜中和して表示2の異なる向きと個眼の対応するフィールド、 ショウジョウバエの頭部の写真を示す。最初の観察中に、（A）、目が配置されているこのような（黄色）またはヘテロ接合性野生型のPRのクローンは赤道（赤線）のレベルで、フィールドの中央に見られること。（B）第2の観察の間、眼は正確ではないことが多い同じ向き。このように、PRの同じグループを再び見つけることができますが、それは表示することはできません（左の）正確に同じフィールド。目が再び表示できるように、同じフィールドの再配向する必要があります。赤道の位置をガイドとして使用することができる。この例では、観測されたフィールドがあまりにも腹で、目がそのため最初の観測のように、再び観察フィールドの中央に赤道を配置するために腹側にオンにする必要がありますことを知っている。 図5。トマト/ GFP-FLP / FRT法により検出されたPRを現像欠陥の例。 （A）内部のPRの損失を示すモザイクシーナ[BG02648]変異型のPRの可視化、。ミュータント個眼では、外側のPRは、内側のPR R7が存在しないために一緒にクラスタ化される。実際、シナ内側PRの動員に必要であることが知られている。モザイクGRHの（B）の可視化[S2140]極性欠損を示す変異体のPR。モザイクミュータント個眼、SURR丸でounded、背腹反転を示す、野生型の個眼から反対方向に向いている。トマト/ GFP-FLP / FRT法による詳細な研究は、GRHは、個眼の極性20の正しい取得のためのR3前駆体に必要とされたことを示した。モザイクCRB [j1B5]変異型のPRS（C）の可視化を、変形したホモ接合変異のPRを示した。 CRBは感桿分体の形態形成に必要であることが知られている。 図6。モザイクFATPの時間経過分析は[k10307]トマト/ GFP-FLP / FRT法による変異体のPRは、14日間かけてモザイクFATPは[k10307]変異型網膜は、1日目（A、A '）で観測され、4日目（ B、B '）、8日目（C、C'）及び孵化後14日目（D、D '）。モザイクのPRの同じグループが財団ことができます各時点でのdは、観察されたフィールド内の（白い長方形、A、B、C、D）。ヘテロ接合およびホモ接合野生型のPRが黄色で標識される一方のPR（A '、B'、C '、D'）のこの分野において、ホモ接合変異体のPRは、緑色で標識される。 4日目（B '）以降から、ホモ接合変異PRSはFATPは[k10307]変異は、これらのPRの進行性変性を誘導することを示し、消え始める。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 図7。モザイクコントロールのミニホワイト運ぶFATP発現構築。モザイクのPRを15日齢のハエにおけるトマト/ GFP-FLP / FRT方法で可視化されています。（A）の可視化とFATPの救出は、[k10307]変異型のPRのPR。 （B）V変異体のPRの損失モザイク。（C）可視化を示すモザイクFATP変異体のPRのisualization FATP外側のPR（RH1> FATP）フライreexpressing FATPにおける変異のPR。変異型のPRが救出されています。ミニ白遺伝子の存在とRH1> FATP条件の関連する赤目色素沈着がトマトやGFP蛍光またはクローンの検出を変更しません。