שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כרוכה לדמיין תאי קולטי אור פסיפס בחיים דרוזופילה. ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר גורלם של תאי קולטי אור ברשתית בודד במשך ימים או שבועות. שיטה זו היא אידיאלית ללימודים של ניוון רשתית ומחלות ניווניות או התפתחות תאי קולטי אור.
עין דרוזופילה נעשתה שימוש נרחב כמודל למחקרים של התפתחות וניוון עצבי. עם טכניקת רקומבינציה mitotic רבת עוצמה, מסכי גנטיים אלגנטיים המבוססים על ניתוח משובט הובילו לזיהוי של מסלולי איתות מעורבים בפיתוח העין וקולטי אור בידול (PR) בשלבי זחל. אנו מתארים כאן שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT, אשר יכול לשמש לניתוח משובט מהיר בעין של חיים הבוגרים דרוזופילה. תאי קולטי אור פלורסנט הם צילמו עם טכניקת נטרול קרנית, ברשתית עם שיבוטים פסיפס שנוצרו על ידי רקומבינציה בתיווך flipase. לשיטה זו מספר יתרונות גדולים על פני חתך היסטולוגית קלאסי של הרשתית: ניתן להשתמש בו להקרנת תפוקה גבוהה והוכיח את השיטה יעילה לזיהוי הגורמים המסדירים הישרדות יחסי ציבור ותפקוד. זה יכול לשמש גם לניתוחים הקינטית של ניוון יחסי ציבור באותו ענים חייםאל פני כמה שבועות, כדי להדגים את הדרישה לגנים ספציפיים להישרדות יחסי ציבור או פונקציה בזבוב הבוגר. שיטה זו היא גם שימושית לטיפול בבעיות אוטונומיה תא במוטנטים התפתחותית, כגון אלה שבהקמתה של קוטביות תא מישוריים מושפעת.
רשתית דרוזופילה מורכבת מכ -800 יחידות ommatidial (איור 1 א), אשר מאורגנות בדיוק, עם ציר מוגדר וברור של קוטביות (איור 1). כל יחידה מכילה 20 תאים: שמונה תאי קולטי אור (PRS) ו12 תאי אבזר, כוללים תאים חרוטים, תאי פיגמנט וזיפי תאים 1,2. שני סוגים של יחסי הציבור נבדלים על בסיס הסוג של רודופסין (Rh) שהם מבטאים. שישה הפורטוריקנים החיצוניים (R1-6) להביע RH1 ומסודרים בתבנית בצורת טרפז (איור 1 ג). במרכז הטרפז, שני הפורטוריקנים הפנימיים (R7/R8) להביע את ארבעה סוגים אפשריים של רודופסין (Rh3, Rh4, Rh5 או Rh6) ומאורגנים כך שR7 שקרים על גבי R8 3.
יותר מ 2,500 גנים מעורבים בהמורפוגנזה של העין דרוזופילה 4, אשר הוכיחה את מודל חזק מאוד ללימודים של פנל רחב של תהליכים, כוללים deve העיןlopment, גיוס יחסי ציבור, בידול, קוטביות תא מישוריים, המורפוגנזה, הישרדות, אפופטוזיס ותמרה חזותית 5-9.
חוקרים עובדים על העין דרוזופילה יש, במשך שנים רבות, פיתחו טכניקות הדמיה הרשתית וביצוע מסכי גנטיים שיטתיים. הדרך הקלה ביותר לתמונת הרשתית המבוגר היא להסתכל על הקרנית בבעלי חיים משותקים (איור 1 א). המבנה של הקרנית יכול להיות דמיינו דווקא על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים סורק והיה בשימוש במסך גנטי בקנה מידה גדולה על ידי קונסורציום URCFG (http://www.bruinfly.ucla.edu) 10. זוהי גישה יעילה מאוד להמחשת שינויים הגלובליים מורפולוגיים במבנה קרני, כגון חספוס עין או ברק, לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות בגנים השולטים בשלבים מוקדמים בהתפתחות או כדאיות תא. עם זאת, להדמיה הגלובלית של הקרנית היא לא sufficient לזהות את הגורמים המסדירים את כדאיות המורפוגנזה או יחסי ציבור יחסי הציבור מבוגרים rhabdomere ותפקוד. ניתוח מסוג זה דורש חקירה יסודית יותר של יושרת יחסי הציבור, המבוססת על מיקרוסקופ שלב בניגוד סעיפים שרף חצי דקים המשיקים של 11-13 הרשתית. טכניקה זו מתאימה לניתוחי פסיפס, שבה ניתן לזהות הפורטוריקנים מוטציה על ידי חוסר 14,15 הפיגמנט האדום שלהם.
יכולים גם להיות דמיינו שיבוטים מוטציה פסיפס ובניתוחים כל ההר של רשתית גלמים או מבוגר, על הבסיס של חוסר החלבון פלואורסצנטי ירוק אות (GFP) במיקרוסקופ פלואורסצנטי 16,17. שתי טכניקות אלה שימושיות מאוד, אבל שניהם עבודה וזמן רב ולכן אינו מתאימים להקרנה בקנה מידה גדולה. אנו ואחרים פיתחו את השימוש בטכניקות נטרול קרנית להדמיה של הפורטוריקנים ייצור חלבוני ניאון 18,19, כדי להקל על יחסי ציבור מהירים מנתח. בעזרת טכניקה, זה מוטציהניתן לזהות שיבוטים על בסיס autofluorescence של הפיגמנט האדום (w +) בשיבוטי דרוזופילה מבוגרים פסיפס. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת את הרזולוציה התא הבודד הדרושה לטיפול באוטונומית תא מנפיקה 19. התגברנו על בעיה זו על ידי פיתוח שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT, המשלבת את ההדמיה של חלבוני ניאון על ידי נטרול קרנית עם רקומבינציה mitotic 20. שיטה זו מאפשרת תפוקה גבוהה, זיהוי מהיר ומדויק של הפורטוריקנים מוטציה בשיבוטי פסיפס, ברזולוציה של תא בודד (http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/). הוא מתאים לשימוש בניתוחים הקינטית, לבא הפורטוריקנים בודדים על פני תקופה של שבועות בחיים דרוזופילה. אנו מתארים כאן שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT וטיפים לשימוש בו בניתוחים פשוטים, הקינטית של עיני פסיפס.
עין דרוזופילה כבר בשימוש נרחב כדי לפענח את מסלולי איתות ויסות פיתוח, שגשוג והישרדות. בתחילת 1990, מספר גדול של מסכים גנטי בוצע על מנת לזהות את המסלולים הנדרשים במהלך השלבים הראשונים של פיתוח יחסי ציבור 25-27. היעילות של מסכי גנטיים גדלה במידה רבה על ידי טכניקת רקומבינציה mitotic, מה שהופך את זה אפשר לבדוק מוטציות אובדן של פונקציה בשיבוטי פסיפס 21. לפיכך, תפקידה של מוטציות קטלניות עובריים יכול להיבדק באופן שיטתי בשיבוטי מוטציה הומוזיגוטים בעיניים של זבובים שהיו אחרת הטרוזיגוטיים. רוב הקרנות הפסיפס התמקדו בגיוס יחסי הציבור המוקדם, הבידול, הקרנת אקסון או המורפוגנזה מתרחשת בזחלים או גלמי 10,25-31 המתפתחים. עד כה, רק אחד מסך פסיפס חקר את מנגנוני ויסות תפקוד יחסי ציבור מבוגרים, על ידי ניטור התגובה החזותית באמצעות electroretinogram הקלטות 32. עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT והאפשרות של ביצוע ניתוח כמובן זמן חי חיות שעברו מוטציה, יש לנו תוכננו שיטה חדשה לזיהוי הגורמים המסדירים את יכולת קיום יחסי ציבור מבוגר ולתפקד 20,24.
יש שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כמה יתרונות גדולים על פני חתך היסטולוגית הקלאסי של עיניים משובצות שרף. ראשית, שיטה זו היא הרבה יותר מהר, זול יותר וקל יותר לביצוע מאשר השיטה היסטולוגית, ובלבד שמיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במטרת טבילת מים מתאימה הוא זמין (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד). שנית, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT יכולה לשמש בשילוב עם ביטוי transgene, כגון הביטוי של P (כטב"מ, W +), שנשאה transgene מיני לבן. בניגוד לסעיפים היסטולוגית, שבי + w משמש לזיהוי משובט, במערכת העגבניות / GFP-FLP / FRT, P (כטב"מ, W +) לא מפריע ד המשובטetection מבוסס על חלבון פלואורסצנטי עגבניות. באמצעות P (כטב"מ-fatp, W +) זבובים מהונדסים, היינו יכול לדמיין את ההצלה של הפורטוריקנים מוטציה fatp (איור 7). שלישית, מכשול עיקרי של כל סוגי ניתוח משובט, ובכלל זה המבוסס על העגבניות / GFP-FLP / FRT, היא העמימות של גנוטיפ של הפורטוריקנים לאיבוד. ואכן, זה עשוי להיות לא ברור אם יחסי ציבור נעדר בגלל חוסר תפקוד גן מסוים או בגלל השפעה בלתי אוטונומית תא, במיוחד בגבול של השיבוט שעבר מוטציה. שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT מקבלת לעקוף בעיה זו לניוון על ידי כך שניתן לעקוב wild-type ו הפורטוריקנים מוטציה באותו בעל חיים על פני תקופות של מספר שבועות. היינו מסוגל לעקוב אחר גורלם של הפורטוריקנים פרט על ידי הקינטית ניתוחים על זבובים שעברו מוטציה fatp שונים (איור 6). אותו השיבוט יכול להיות מוכר בבעלי חיים ניתנו בזמנים שונים, בגלל צורתו המדויקת של השיבוטים פראי מהסוג שמסביב. אנחנו הצלחנו להראות חד משמעיly שכל הפורטוריקנים החסרים היו מוטציה לfatp, מצביעים על כך שתפקידם של מוטציות fatp בהפורטוריקנים הוא תאים אוטונומיים. לכן, על ידי ניטור אובדן הפורטוריקנים בניתוח קינטי, ניתן לקבוע את הגנוטיפ של הפורטוריקנים במודלים של ניוון ממבוגרים. לבסוף, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT הוכיחה חזקה מאוד לזיהוי של גורמים המסדירים את הקמתה של PCP 20. האפשרות של הבקיע מספר רב של האומטידיה פסיפס לפנוטיפ קוטביות ללא הצורך בחלקים, מאפשרת קביעה מהירה של דרישת יחסי הציבור להקמתה של PCP. עם זאת, ניתוח של יושרת יחסי הציבור עדין ידרוש חתך מסורתי ואחריו שלב בניגוד או microscopies האלקטרוני.
לסיכום, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT פותחת אפשרויות חדשות לסינון פסיפס יעיל כדי לזהות גורמים המסדירים את תהליכי התפתחות יחסי ציבור ופונקציות יחסי ציבור בוגרים, כגון מולתגובת רע"מ ויכולת קיום.
The authors have nothing to disclose.
מתקני PLATIM וDroso כלים של UMS3444 Biosciences, ליון, צרפת. המחקר של BM נתמכה על ידי מענקים מFondation לשפוך la משוכלל ונדיר Médicale מCNRS (ATIP) וANR-12-BSV1-0,019-01. פ"ד נתמכה על ידי רשתית צרפת עמותה ואקול נורמל סופרייר בליון (צרפת). CL נתמכה על ידי La Ligue Nationale contre le סרטן עמותה.
Reagent | |||
Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
[HEADER] | |||
Equipment | |||
Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |