Den Tomat / GFP-FLP / FRT metod innebär att visualisera mosaik fotoreceptorceller i levande Drosophila. Den kan användas för att följa individuella fotoreceptorcellöden i näthinnan i dagar eller veckor. Den här metoden är idealisk för studier av retinal degeneration och neurodegenerativa sjukdomar eller fotoreceptorcellutveckling.
Den Drosophila ögat används allmänt som en modell för studier av utveckling och neuronal degenerering. Med den kraftfulla mitotiska rekombination, har eleganta genetiska skärmar baserade på klonal analys ledde till identifieringen av signalvägar som är involverade i ögonutveckling och fotoreceptor (PR) differentiering på larvstadier. Vi beskriver här den Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden, som kan användas för snabb klonal analys i ögat av levande vuxna Drosophila. Fluorescerande ljusmätare celler avbildas med hornhinnan neutralisering tekniken, på näthinnor med mosaik kloner genereras av flipase medierad rekombination. Denna metod har flera stora fördelar jämfört med klassiska histologiska sektionering av näthinnan: den kan användas för high-throughput screening, och har visat sig vara en effektiv metod för att identifiera de faktorer som reglerar PR överlevnad och funktion. Den kan användas för kinetiska analyser av PR degeneration i samma levande animal under flera veckor, för att visa att kravet på specifika gener för PR överlevnad eller funktion i den vuxna flugan. Denna metod är också användbar för att ta itu med cellautonomifrågor i utvecklings mutanter, exempelvis sådana där etableringen av plana cell polaritet påverkas.
The Drosophila näthinnan består av cirka 800 ommatidial enheter (Figur 1A), som just organiserad, med en klart definierad axel polaritet (Figur 1B). Varje enhet innehåller 20 celler: åtta fotoreceptorceller (PRS) och 12 tillbehörs celler, inklusive kon celler, pigmentceller och borst celler 1,2. Två klasser av PR särskiljs på grundval av den typ av rhodopsin (Rh) de uttrycker. De sex yttre PRs (R1-6) uttrycker RH1 och är anordnade i en trapetsoid mönster (Figur 1C). I centrum av trapetsen, de två inre PRs (R7/R8) uttrycker fyra möjliga typer av rhodopsin (RH3, RH4, RH5 eller RH6) och är organiserade så att R7 ligger på toppen av R8 3.
Mer än 2.500 gener är involverade i morfogenes av Drosophila ögat 4, vilket har visat sig vara en mycket kraftfull modell för studier av en bred panel av processer, bland annat ögon utveckling, PR rekrytering, differentiering, planar cell polaritet, morfogenes, överlevnad, apoptos och visuella transduktion 5-9.
Forskare som arbetar på Drosophila ögat har, under många år, utvecklade tekniker för avbildning av näthinnan och genomför systematiska genetiska skärmar. Det enklaste sättet att bilden den vuxna näthinnan är att titta på hornhinnan i en immobiliserad djur (Figur 1A). Strukturen av hornhinnan kan visualiseras exakt genom svepelektronmikroskopi och användes i en storskalig genetisk skärmen av URCFG konsortium ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Detta är en mycket effektiv metod för att visualisera globala morfologiska förändringar i hornhinnans struktur, såsom ögon ojämnheter eller glans, ofta framkallade av mutationer i gener som kontrollerar tidiga steg i utvecklingen eller cellernas livskraft. Emellertid är inte su globala visualisering av hornhinnanfficient att identifiera de faktorer som reglerar PR rhabdomere morfogenes eller en vuxen PR livskraft och funktion. Sådana analyser kräver en mer grundlig utredning av PR integritet, baserat på faskontrastmikroskopi tangentiella semi-tunna sektioner av näthinnan 11-13 harts. Denna teknik är lämplig för mosaik analyser, där muterade PRs kan identifieras genom deras brist på rött pigment 14,15.
Mosaik mutanta kloner kan också visualiseras i hela montering dissektioner av pupal eller vuxen näthinnan, på grundval av deras avsaknad av grönt fluorescerande protein signal (GFP) på fluorescensmikroskopi 16,17. Dessa två tekniker är mycket användbara, men båda är arbets-och tidskrävande och är därför inte lämplig för storskalig screening. Vi och andra har utvecklat användningen av hornhinnan Neutralisering för avbildning av PRs producerar fluorescerande proteiner 18,19, för att underlätta snabb PR analyser. Med denna teknik, mutantkloner kan identifieras på basis av autofluorescens av den röda (w +) pigment i mosaik vuxna Drosophila kloner. Men denna metod inte ger den encelliga upplösning som krävs för att ta itu med cell autonomi frågor 19. Vi löste problemet genom att utveckla Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden, som kombinerar avbildning av fluorescerande proteiner genom hornhinnan neutralisering med mitotiska rekombination 20. Denna metod gör det möjligt att med hög genomströmning, snabb och exakt identifiering av muterade PRs i mosaik kloner, vid encelliga upplösning ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Den är lämplig för användning i kinetiska analyser, för att följa enskilda PRs under en period av veckor i levande Drosophila. Vi beskriver här den Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden och tips för dess användning i enkla, kinetiska analyser av mosaik ögon.
Drosophila ögat har i stor utsträckning använts för att dechiffrera de signalvägar som reglerar utveckling, spridning och överlevnad. I början av 1990-talet ett stort antal genetiska skärmar gjorts för att identifiera de vägar som krävs under de inledande faserna av PR utveckling 25-27. Effektiviteten av genetiska skärmar har ökat kraftigt genom den mitotiska rekombination teknik, som gör det möjligt att testa förlust-av-funktion mutationer i mosaik kloner 21. Därför kunde testas roll embryonala letala mutationer systematiskt homozygota muterade kloner i ögonen av flugor som var annars heterozygot. De flesta mosaik filmvisningar har fokuserat på den tidiga PR rekrytering, differentiering, axonal projektion eller morfogenes inträffar i utvecklings larver eller puppor 10,25-31. Hittills har endast en mosaik skärm undersökt de mekanismer som reglerar vuxen PR-funktion, genom att övervaka visuell respons via electroretinogram inspelningar 32. Med Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden och möjligheten att utföra tidsförloppet analys i levande muterade djur, har vi utformat en ny metod för att identifiera de faktorer som reglerar vuxen PR livskraft och funktion 20,24.
Den Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden har flera stora fördelar jämfört med den klassiska histologiska sektionering av harts inbäddade ögon. För det första är denna metod mycket snabbare, billigare och enklare att utföra än den histologiska metod, förutsatt att en fluorescensmikroskop utrustat med en lämplig vatten doppa mål är tillgänglig (se tabell av reagenser och utrustning). För det andra kan Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden användas i samband med transgent uttryck, såsom uttrycket av P (UAS, v ^), som bär en mini-vit transgen. I motsats till histologiska sektioner, i vilka W + används för klonal detektion, i tomat / GFP-FLP / FRT-systemet, P (UAS, v +) inte interfererar med klonal detection baserade på tomat fluorescerande protein. Med hjälp av P (UAS-fatp, w +) transgena flugor, kunde vi visualisera att rädda fatp muterade PRs (Figur 7). För det tredje, en viktig fallgrop av alla typer av klonal analys, bland annat att utifrån Tomat / GFP-FLP / FRT är tvetydigheten i genotypen av förlorade PRs. I själva verket kan det vara oklart om en PR är frånvarande på grund av avsaknaden av en specifik genfunktion, eller på grund av en cell icke-autonom verkan, i synnerhet vid den kant av den mutanta klonen. Den Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden blir runt detta problem för degenerering genom att göra det möjligt att följa vildtyp och muterade PRs i samma djur under perioder om flera veckor. Vi kunde följa vad som händer med de enskilda PRs genom kinetiska analyser på olika fatp muterade flugor (Figur 6). Samma klon kan identifieras i ett givet djur vid olika tidpunkter, på grund av den exakta formen av de omgivande vildtyp kloner. Vi kunde visa entydigtly att alla de saknade PRs var mutanta för fatp, vilket indikerar att rollen för fatp mutanter i PRs är cellautonoma. Således genom att övervaka förlusten av PRs i en kinetisk analys, är det möjligt att bestämma genotypen av PRs i modeller av vuxen debuterande degeneration. Slutligen har Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden visade sig vara mycket kraftfullt för att identifiera faktorer som reglerar inrättandet av PCP 20. Möjligheten att ha dödat ett stort antal mosaik ommatidia för en polaritet fenotyp utan behov av sektioner, underlättar snabb bestämning av PR kravet på inrättande av PCP. Trots detta skulle finare analys av PR integritet kräver traditionella snitt följt av fas-kontrast eller elektroniska microscopies.
Sammanfattningsvis öppnar Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden nya möjligheter för effektiv mosaik screening för att identifiera faktorer som reglerar PR utvecklingsprocesser och vuxen PR-funktioner, till exempel visUAL svar och livskraft.
The authors have nothing to disclose.
PLATIM och Droso-Tools anläggningar i UMS3444 Biosciences, Lyon, Frankrike. BM: s forskning har finansierats med bidrag från Fondation pour la Recherche Médicale från CNRS (ATIP) och ANR-12-BSV1-0019-01. PD fick stöd av Retina Frankrike föreningen och Ecole Normale Supérieure i Lyon (Frankrike). CL stöddes av La Ligue Nationale contre le Cancer föreningen.
Reagent | |||
Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
[HEADER] | |||
Equipment | |||
Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |