Tomat / GFP-FLP / FRT metoden innebærer å visualisere mosaikk fotoreseptorcellene i levende Drosophila. Den kan brukes til å følge individuelle fotoreseptor celle skjebner i netthinnen i dager eller uker. Denne metode er ideelt for studier av retinal degenerasjon og nevrodegenerative sykdommer eller fotoreseptoren celleutvikling.
Drosophila øyet er mye brukt som en modell for studier av utvikling og nevronale degenerasjon. Med den kraftige mitotisk rekombinasjon teknikk, har elegante genetiske skjermer basert på klonal analyse førte til identifisering av signalveier involvert i øye utvikling og fotoreseptoren (PR) differensiering på larvestadiet. Vi beskriver her tomat / GFP-FLP / FRT metode, som kan brukes for hurtig klonal analyse i øyet av levende voksen Drosophila. Fluorescent fotoreseptorcellene er avbildes med hornhinnen nøytralisering teknikk, på netthinne med mosaikk kloner generert av flipase-mediert rekombinasjon. Denne metoden har flere viktige fordeler i forhold til klassiske histologisk seksjonering av netthinnen: den kan brukes for high-throughput screening, og har vist seg å være en effektiv metode for å identifisere faktorer som regulerer PR overlevelse og funksjon. Den kan brukes for kinetiske analyser av PR degenerasjon i samme levende Animal over flere uker, for å demonstrere kravet til spesifikke gener for PR overlevelse eller funksjon i voksen flue. Metoden er også nyttig for å ta opp celle autonomi problemer i utviklings mutanter, for eksempel de hvori etableringen av plane celle polaritet forandres.
Den Drosophila retina er sammensatt av omtrent 800 ommatidial enheter (figur 1A), som er nøyaktig organisert, med et klart definert akse polaritet (figur 1B). Hver enhet inneholder 20 celler: åtte fotoreseptoren celler (PRS) og 12 tilbehørs celler, inkludert koniske celler, pigmentceller og bust celler 1,2. To klasser av PR utmerker seg på grunnlag av den type rhodopsin (Rh) de uttrykker. De seks ytre prs (R1-6) uttrykker RH1, og er anordnet i et trapes mønster (figur 1C). I sentrum av den trapes, de to indre PRS (R7/R8) uttrykker fire mulige typer rhodopsin (RH3, RH4, RH5 eller RH6) og er organisert slik at R7 ligger på toppen av R8 3..
Mer enn 2500 gener som er involvert i morfogenese av Drosophila øye 4, noe som har vist seg å være en svært kraftig modell for studier av et bredt panel av prosesser, inkludert øye utvikling, PR rekruttering, differensiering, planar celle polaritet, morphogenesis, overlevelse, apoptose og visuell transduksjon 5-9.
Forskere som arbeider på Drosophila øyet har, gjennom mange år utviklet teknikker for bildebehandling netthinnen og gjennomføre systematiske genetiske skjermer. Den enkleste måten å avbilde voksen netthinnen er å se på hornhinnen i en immobilisert dyr (figur 1A). Strukturen i hornhinnen kan visualiseres nettopp ved scanning elektronmikroskopi og ble brukt i en storstilt genetisk skjermen ved URCFG konsortium ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Dette er en svært effektiv metode for å visualisere globale morfologiske endringer i hornhinnen struktur, for eksempel øye ruhet eller glans, ofte forårsaket av mutasjoner i gener som styrer tidlige trinn i utvikling eller celle levedyktighet. Imidlertid er global visualisering av hornhinnen ikke sufficient å identifisere hvilke faktorer som regulerer PR rhabdomere morfogenese eller voksen PR levedyktighet og funksjon. Slike analyser krever en mer grundig undersøkelse av PR integritet, basert på fasekontrastmikroskopi av tangential semi-tynne harpiks deler av netthinnen 11-13. Denne teknikken er egnet for mosaikk analyser, der muterte PRS kan identifiseres av deres mangel på røde pigment 14,15.
Mosaikk mutant kloner kan også visualiseres i hel-mount disseksjoner av pupal eller voksen netthinnen, på grunnlag av deres mangel på grønt fluorescerende protein (GFP) signal på fluorescens mikros 16,17. Disse to teknikker er meget nyttig, men begge er arbeids-og tidkrevende, og er derfor ikke egnet for storskala-screening. Vi og andre har utviklet bruken av hornhinnen nøytraliseringstanker teknikker for avbildning av PRS produserer fluorescerende proteiner 18,19, for å legge til rette for rask PR-analyser. Med denne teknikken, mutantkloner kan identifiseres på grunnlag av autofluorescens av det røde (w +) pigment i mosaikk voksen Drosophila kloner. Men denne metoden ikke gir den encellede oppløsning som kreves for å ta celle autonomi utsteder 19. Vi overvant dette problemet ved å utvikle Tomato / GFP-FLP / FRT metode, som kombinerer bildebehandling av fluorescerende proteiner ved hornhinnen nøytralisering med mitotisk rekombinasjon 20. Denne metoden gjør at høy gjennomstrømning, rask og presis identifisering av muterte PRS i mosaikk kloner, på encellede oppløsning ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Den er egnet for bruk i kinetiske analyser for å følge de enkelte PRS over en periode på uker i levende Drosophila. Vi beskriver her tomat / GFP-FLP / FRT metode og tips for bruk i enkle, kinetiske analyser av mosaikk øyne.
Drosophila øyet har vært mye brukt for å dechiffrere den signalveier som regulerer utvikling, spredning og overlevelse. På begynnelsen av 1990-tallet, ble et stort antall genetiske skjermer gjennomført for å identifisere trasé som kreves i de innledende fasene av PR utvikling 25-27. Effektiviteten av genetiske skjermene ble økt i stor grad av den mitotiske rekombinasjon teknikk, som gjør det mulig å teste tap-av-funksjon-mutasjoner i mosaikk kloner 21. Derfor kunne rollen som embryonale dødelige mutasjoner systematisk testet i homozygot mutant kloner i øynene av fluer som var ellers heterozygot. De fleste mosaikk screenings har fokusert på tidlig PR rekruttering, differensiering, axonal projeksjon eller morfogenese forekommer i utviklings larver eller pupper 10,25-31. Hittil har bare én mosaikk skjermen undersøkt de mekanismene som regulerer voksen PR-funksjon, ved å overvåke den visuelle respons via electroretinogram Recordings 32. Med tomat / GFP-FLP / FRT metode og muligheten for tidsforløpet analyse utfører i levende muterte dyr, har vi utviklet en ny metode for å identifisere hvilke faktorer som regulerer voksen PR levedyktighet og fungere 20,24.
Tomat / GFP-FLP / FRT metoden har flere store fordeler fremfor den klassiske histologisk seksjonering av harpiks-embedded øyne. Først, er denne metoden mye raskere, billigere og enklere å utføre enn den histologiske metode, forutsatt at en fluorescens mikroskop utstyrt med et passende vann dipping Målet er tilgjengelig (se tabell av reagenser og utstyr). For det andre kan den Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden bli brukt i forbindelse med transgene ekspresjon, så som ekspresjon av P (UAS, w +), som bærer en mini-white transgenet. I motsetning til histologiske snitt, der w + brukes for klonal deteksjon, i tomat / GFP-FLP / FRT system, P (UAS, w +) ikke forstyrrer klonal detection basert på Tomato fluorescerende protein. Ved hjelp av P (UAS-fatp, w +) transgene fluer, var vi i stand til å visualisere redning av fatp mutant PRS (figur 7). Tredje, en viktig fallgruve av alle typer klonal analyse, herunder at basert på tomat / GFP-FLP / FRT, er tvetydigheten i genotype av tapte PRS. Faktisk kan det være uklart hvorvidt en PR er fraværende på grunn av mangel på en spesifikk genfunksjon, eller på grunn av en celle ikke-autonomt effekt, spesielt ved grensen av mutant klon. Tomat / GFP-FLP / FRT metoden får rundt dette problemet for degenerasjon ved å gjøre det mulig å følge villtype og mutant PRS i samme dyr over perioder på flere uker. Vi var i stand til å følge skjebnen til enkelt PRs av kinetisk analyser på ulike fatp mutant fluer (figur 6). Den samme klon kan gjenkjennes i et gitt dyr på forskjellige tidspunkter, på grunn av den nøyaktige formen på de omliggende vill-type-kloner. Vi var i stand til å vise entydigly at alle de manglende PRs var mutant for fatp, noe som indikerer at rollen som fatp mutanter i PRS er celle-autonomt. Således, ved å overvåke tapet av PRS i en kinetisk analyse, er det mulig å bestemme genotypen til PRS i modeller av voksen alder degenerasjon. Endelig har Tomat / GFP-FLP / FRT-metoden vist seg å være meget kraftig for identifisering av faktorer som regulerer etableringen av PCP 20. Muligheten for å utføre et stort antall mosaikk ommatidia for en polaritet fenotype uten behov for seksjonene, muliggjør hurtig bestemmelse av den PR-kravet for etablering av PCP. Likevel ville finere analyse av PR integritet krever tradisjonell seksjonering fulgt av fase-kontrast eller elektroniske microscopies.
I konklusjonen, åpner Tomato / GFP-FLP / FRT metoden opp nye muligheter for effektiv mosaikk screening for å identifisere faktorer som regulerer PR utviklingsprosesser og voksen PR-funksjoner, som for eksempel visUAL respons og levedyktighet.
The authors have nothing to disclose.
PLATIM og Droso-Tools fasilitetene på UMS3444 biovitenskap, Lyon, Frankrike. BM forskning ble støttet med tilskudd fra Fondation pour la Recherche MEDICALE fra CNRS (ATIP) og ANR-12-BSV1-0019-01. PD ble støttet av Retina Frankrike foreningen og Ecole Normale Supérieure i Lyon (Frankrike). CL ble støttet av La Ligue Nationale contre le Cancer Association.
Reagent | |||
Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
[HEADER] | |||
Equipment | |||
Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |