Метод Томатный / GFP-ФЛП / FRT включает визуализацию мозаичные клетки фоторецептора в живых дрозофилы. Он может быть использован, чтобы следовать индивидуальные судьбы фоторецепторов клеток в сетчатке в течение нескольких дней или недель. Этот метод идеально подходит для исследований дегенерации сетчатки и нейродегенеративных заболеваний или развития фоторецепторов клеток.
Дрозофилы глаз широко используется как модель для изучения развития и дегенерации нейронов. С мощной техники митотический рекомбинации, элегантные генетические экраны на основе клонального анализа привели к идентификации сигнальных путей, участвующих в развитии глаза и фоторецепторов (PR) дифференциация на личиночной стадии. Мы опишем здесь метод томатный / GFP-FLP / FRT, который может быть использован для быстрого клонального анализа в глазу живых взрослых дрозофилы. Флуоресцентные клетки фоторецепторов изображаются с техникой роговицы нейтрализации, на сетчатке с мозаичными клонов, порождаемых flipase опосредованной рекомбинации. Этот метод имеет несколько основных преимуществ по сравнению с классической гистологического срезов сетчатки: он может быть использован для высокопроизводительного скрининга и оказалась эффективным способ идентификации факторов, регулирующих выживание PR и функции. Он может быть использован для кинетических анализов PR дегенерации в том же гостиной Анимдр. в течение нескольких недель, чтобы продемонстрировать потребность в специфических генов для выживания PR или функции во взрослой мухи. Этот метод также полезен для решения вопросов автономии клеток у мутантов развития, таких, как те, в которых зависит установление плоской полярности клеток.
Drosophila сетчатка состоит из около 800 омматидий единиц (рис. 1А), которые точно организованных, с четко определенной оси полярности (рис. 1В). Каждый блок содержит 20 клетки: восемь клетки фоторецепторов (ССБ) и 12 вспомогательных клеток, в том числе колбочек, пигментных клеток и щетины ячеек 1,2. Два класса PR отличаются на основе типа родопсина (Rh) они выражают. Шесть внешние ОР (R1-6) выражать RH1 и расположены в трапеции шаблон (рисунок 1С). В центре трапеции, две внутренние ОР (R7/R8) выразить четыре возможные типы родопсина (RH3, RH4, RH5 или Rh6) и организованы таким образом, что R7 лежит на верхней части R8 3.
Более 2500 гены вовлечены в морфогенезе Drosophila глаз 4, которая оказалась очень мощную модель для изучения широкого панели процессов, в том числе глаз развитию, PR вербовка, дифференциация, плоская клеточной полярности, морфогенез, выживание, апоптоз и визуальный трансдукции 5-9.
Исследователи, работающие на глаз дрозофилы есть, на протяжении многих лет, разработка методов визуализации сетчатки и проведения систематических генетические экраны. Самый простой способ изображения взрослый сетчатка смотреть на роговице в иммобилизованной животного (рис. 1А). Структура роговицы могут быть визуализированы именно сканирующей электронной микроскопии и был использован в генетическом скрининге крупномасштабного по URCFG консорциума ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Это очень эффективный подход для визуализации глобальных морфологические изменения в роговицы структуры, такие как шероховатость глаз или блеска, часто вызванные мутациями в генах, контролирующих первые шаги в развитии или жизнеспособности клеток. Тем не менее, глобальная визуализация роговицы не суfficient, чтобы определить факторы, регулирующие PR рабдомера морфогенез или взрослого PR жизнеспособность и функцию. Такой анализ требует более тщательного расследования целостности PR, основанный на фазово-контрастной микроскопии касательных полу-тонких полимерных участков сетчатки 11-13. Этот метод подходит для мозаичных анализов, в которых мутантные ОР могут быть идентифицированы по их отсутствия красного пигмента 14,15.
Мозаика мутантные клоны также могут быть визуализированы в целом монтажа Препарируя куколки или взрослой сетчатке, на основании их отсутствия зеленого флуоресцентного белка (GFP) сигнала на флуоресцентной микроскопии 16,17. Эти две технологии очень полезны, но оба труда и времени и, следовательно, не подходит для крупномасштабного скрининга. Мы и другие разработали использование методов роговицы нейтрализации для визуализации ОР производящих флуоресцентные белки 18,19, для облегчения быстрого PR анализов. С помощью этой техники, мутантаклоны могут быть идентифицированы на основе флуоресценции красного (W +) пигмента в мозаичных взрослых Drosophila клонов. Однако этот способ не обеспечивает решение одной клетки необходимы для решения автономию клеток выдает 19. Мы преодолели эту проблему, разработав метод Томатный / GFP-ФЛП / FRT, которая сочетает в визуализации флуоресцентных белков по роговицы нейтрализации митотической рекомбинации 20. Этот метод позволяет с высокой пропускной способностью, быстро и точно идентифицировать мутантных ОР в мозаичных клонов, с разрешением одноклеточных ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Это подходит для использования в кинетических анализов, для следующих отдельных ОР в течение недели в живых дрозофилы. Мы описываем здесь метод Томатный / GFP-ФЛП / FRT и советы для его использования в простых, кинетических анализов мозаичных глазами.
Дрозофилы глаз широко используется расшифровать сигнальные пути, регулирующие разработку, распространение и выживание. В начале 1990-х, большое количество генетических экранов проводились для выявления путей, необходимых на начальных этапах развития PR 25-27. Эффективность генетических экранов было значительно увеличился на митотического техники рекомбинации, что позволяет протестировать с потерей функции мутации в мозаичных клонов 21. Таким образом, роль эмбриональных летальных мутаций может быть систематически протестированы в гомозиготных мутантных клонов в глазах мух, которые в противном случае гетерозиготным. Большинство мозаичные показы были сосредоточены на ранней набора PR, дифференциации аксонов проекции или формообразования, происходящих в развивающихся личинок или куколок 10,25-31. На сегодняшний день только один мозаика экран исследовал механизмы, регулирующие функцию взрослых PR, путем мониторинга визуальный ответ через electroretinОГР А ММЫ записи 32. С помощью метода Томатный / GFP-ФЛП / FRT и возможность проведения анализа время курса в живых мутантов животных, мы разработали новый метод выявления факторов, регулирующих взрослых PR жизнеспособность и функционировать 20,24.
Метод Томатный / GFP-ФЛП / FRT имеет несколько основных преимуществ по сравнению с классической гистологического срезов смоляных встраиваемый глазами. Во-первых, этот метод гораздо быстрее, дешевле и легче выполнять, чем гистологического метода, при условии, что флуоресцентный микроскоп оснащен соответствующим воды погружения цели доступно (см. таблицу реагентов и оборудования). Во-вторых, метод томатный / GFP-FLP / FRT может быть использован в сочетании с экспрессии трансгена, такой как выражение P (БАС, W +), проведение мини-белый трансген. В отличие от гистологических срезов, в которых W + используется для клонального обнаружения, в системе Томатный / GFP-ФЛП / FRT, P (БАС, W +) не мешает клонального гetection на основе помидоров флуоресцентного белка. Использование P (БАС-fatp, W +) трансгенных мух, мы были в состоянии представить себе спасение fatp мутантных ОР (рис. 7). В-третьих, одним из ключевых ловушка всех видов клонального анализа, включая, что на основе помидоров / GFP-ФЛП / FRT, является неоднозначность генотипа утраченных ОР. Действительно, это может быть неясно, является ли PR отсутствует из-за отсутствия определенной функции гена или из-за клеточной неавтономной эффект, особенно на границе мутантного клона. Метод Томатный / GFP-ФЛП / FRT обходит эту проблему для дегенерации, делая возможным следовать дикого типа и мутантных ОР в том же животного в течение периода от нескольких недель. Мы смогли проследить судьбу отдельных ОР кинетическими анализирует на разных fatp мутантных мух (рис. 6). То же клон может быть признано в данной животного в разное время, в связи с точной форму окружающих клонов дикого типа. Мы смогли показать однозначнойлы, что все недостающие ОР были мутантные по fatp, указывая, что роль fatp мутантов в ОР клеточноподобно автономными. Таким образом, путем мониторинга потерю ОР в кинетического анализа, можно определить генотип ССБ в моделях взрослом возрасте дегенерации. Наконец, метод Томатный / GFP-ФЛП / FRT оказалось очень мощным для идентификации факторов, регулирующих создание PCP 20. Возможность забил большое количество мозаики омматидиев для фенотипа полярности без необходимости секций, облегчает быстрое определение требованием PR для установления PCP. Тем не менее, тонкий анализ целостности PR потребует традиционный секционирования затем поэтапного отличие или электронных микроскопии.
В заключение, метод Томатный / GFP-ФЛП / FRT открывает новые возможности для эффективного мозаики скрининга для выявления факторов, регулирующих PR процессы развития и взрослых PR функции, такие как по отношениюответ UAL и жизнеспособность.
The authors have nothing to disclose.
PLATIM и Droso-Tools средства на UMS3444 Biosciences, Лионе, Франция. Исследования BM была поддержана грантами от Fondation Pour La Recherche Medicale из CNRS (ATIP) и ANR-12-BSV1-0019-01. PD поддержали Retina Франции ассоциации и Высшей нормальной школе в Лионе (Франция). CL поддержали La Ligue Nationale Контр ле рака ассоциации.
Reagent | |||
Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
[HEADER] | |||
Equipment | |||
Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |