Summary

종양 표적의 측정 성장과 유전자 발현 역학<em> S. 티피 뮤 리움</em> 박테리아

Published: July 06, 2013
doi:

Summary

이 실험의 목적은 감쇠의 성장과 유전자 발현 역학 양적 시간 코스 데이터를 생성하는 것입니다<em> S. 티피 뮤 리움</em종양 내부 성장> 세균성 식민지. 이 비디오는 종양 세포의 준비와 주입, 박테리아 준비 및 사출, 전체 – 동물 발광 이미징, 종양 절제 및 세균성 식민지 계산을 다룹니다.

Abstract

이 실험의 목적은 감쇠 S.의 성장과 유전자 발현 역학 양적 시간 코스 데이터를 생성하는 것입니다 종양 내부 성장 티피 뮤 리움 박테리아 식민지.

우리는 인간의 난소 암 세포주의 피하 주사, OVCAR-8 (NCI DCTD 종양 저장소 프레 더릭, 메릴랜드).에 의해 생쥐 모델 이종 이식 종양을 생성

우리는 S.의 감쇠 균주를 형질 전환 시각화 2 플라스미드 구조적 표현 루시 페라 제 (luxCDABE)와 함께 : 티피 뮤 리움 균 (SL1344 phoPQ-1 ELH430). 마우스 1 본질적으로 비 독성을 유지하면서 이러한 긴장은 특히 종양을 식민지.

측정 종양이 설립되었다되면, 박테리아는 용량을 변화와 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사 하였다. 종양의 지역화, 박테리아 유전자 발현을 사용하여 60시간의 과정을 통해 실시간으로 측정 하였다생체 내 이미징 시스템 (IVIS)합니다. 각 시점에서, 종양은 균질화, 절제, 유전자 발현 데이터와 상관 관계 세균성 식민지를 정량을 도금했다.

함께,이 데이터는 종양 안에 성장 박테리아의 생체 성장과 유전자 발현 역학의 정량적 측정을 얻을 수 있습니다.

Introduction

합성 생물학은 지난 십 년간 급속하게 진행되고 지금은 에너지와 건강에 중요한 문제에 영향을 배치됩니다. 그러나, 임상 분야 ​​진출은 안전 문제 및 생체 내 유전자 회로의 설계 기준을 개발 부재로 둔화되었다. 높은 충격 의료 애플리케이션을 가속화하여 의료 인프라, 제어 실험실 설정 이외의 기능 유전자 회로, 안전하고 임상 승인 미생물 호스트와 직접 인터페이스 방법을 활용해야합니다.

균주의 수는 종양에서 우선적으로 성장 할 수있는 능력으로 인해 암 치료에 조사되었다. 이들은 C.을 포함 novyi, E. 대장균, V. cholorae, B. longum의, 그리고 S. 티피 뮤 리움 3-8. S. 그들은 9-12 인간의 임상 실험의 숫자에 안전성과 내성을 전시 것처럼 티피 뮤 리움 특히 관심을 생성했습니다. 이 bacteri 처음에 숙주 면역 체계의 자극을 통해 암 세포의 신진 대사에 필요한 영양소의 결핍에 의한 항 종양 효과를 만들 보였다. 치료화물의 생산은 이후 유전자 변형을 통해 추가되었습니다. 이 연구는 종양 치료를위한 박테리아의 사용에 중요한 진보를 대표하는 동안, 기존의 노력의 대부분은 일반적으로 높은 복용량, 오프 대상 효과 및 호스트 저항 13-16 개발의 배달 결과 높은 수준의 표현에 의존 .

이제, 합성 생물학 고급 감지 및 배달 17-20을 수행 할 수 계산 설계 유전자 회로를 이용하여 프로그래밍화물의 생산을 추가 할 수 있습니다. 이 회로는 종양 특정 자극하고 필요한 자기 조절화물의 생산을 감지 배달 시스템으로 작동하도록 설계 할 수 있습니다. 그러나 생체 내에서 이러한 회로의 기능을 공부하는 것은 지금까지 도전하고있다.

플라스미드 합성 회로를위한 공통 프레임 워크입니다 ve_content "> 때문에, 우리는 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 플라스미드 기반의 유전자 발현의 역학을 특성화하는 방법을 설명합니다.이 방법은 시간 경과 발광 이미징 및 생체 분포의 정량적 측정을 사용합니다. 함께, 이러한 접근은 임상 응용을위한 생체 내에서 플라스미드 기반의 네트워크를 공부하기위한 프레임 워크를 제공합니다.

Protocol

1. 세포의 준비 표준 세포 배양 기술을 사용하여 통과 세포주. 이 실험에서, 우리는 OVCAR-8 세포 (NCI DCTD 종양 저장소 프레 더릭, 메릴랜드)를 사용. – 100 % 80 자랄 대상으로 세포를 성장. 5 분 5 ML 트립신으로 세포를 배양 한 후 + FBS는 트립신을 비활성화하는 5 ML RPMI 매체를 추가합니다. 혈구에 수확 수를 셀. 5 × 10 7 세포 / ㎖, 또는 플라스크 당 200 μL의 목표 농도에서 페?…

Representative Results

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 종양 표적 박테리아의 생체 성장과 유전자 발현 역학에 데이터를 생성 할 수 있습니다. 전체적인 흐름은 그림 1에 요약되어 있습니다. 첫 번째 단계에서, 우리는 발광 (블루) 기자 등으로 유전자 발현을 측정하는 IVIS를 사용하여 동물을 박테리아를 주입 (녹색) 및 이미지. 그런 다음, 두 번째 단?…

Discussion

이 절차를 사용하여, 우리는 종양을 식민지화 박테리아의 성장과 유전자 발현 역학 시간 코스를 생성 할 수 있습니다. 이러한 측정은 정기적으로 일괄 문화 나 마이크로 유체 장치에서 체외에서 수행하는 동안, 그들은 생체 내에서 수행하기가 훨씬 더 어렵습니다.

이러한 메서드에 적용 할 수있는 몇 가지 수정이 있습니다. 우리는 우리의 마우스 모델을 생성하?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 원고의 중요한 읽기 및 편집 H. 플레밍 감사합니다. 이 작품은 Misrock 박사 학위 취득 후 친교 (TD) 및 NDSEG 졸업 교제 (AP)에 의해 지원되었다. SNB는 HHMI 탐정이다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe BD Biosciences 309602
3/10 cc Insulin Syringe BD Biosciences 309301
PrecisionGlide Needle BD Biosciences 301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine Invitrogen 11875-119
Ampicillin Sigma Aldrich A0166-5G
LB Agar Broth Sigma Aldrich L2897
Luria-Bertani broth BD Biosciences 244610

Referencias

  1. Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
  2. Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
  3. Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
  4. Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
  5. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
  6. Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Investigación sobre el cáncer. 57 (20), 4537-4544 (1997).
  7. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
  8. Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
  9. Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
  11. Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
  12. Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
  13. Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
  14. Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
  15. Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Investigación sobre el cáncer. 70 (1), 18-23 (2010).
  16. Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Investigación sobre el cáncer. 66 (15), 7647-7652 (2006).
  17. Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
  18. Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  19. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  20. Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
  21. Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
  22. Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
  23. Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511 (2013).
  24. Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  25. Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  26. Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).

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Danino, T., Prindle, A., Hasty, J., Bhatia, S. Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria. J. Vis. Exp. (77), e50540, doi:10.3791/50540 (2013).

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