Crescita di misura e di espressione genica Dinamica di tumore-mirata<em> S. Typhimurium</em> Batteri
Summary
L'obiettivo di questi esperimenti è generare dati quantitativi di andamento sulla crescita e la dinamica di espressione genica di attenuato<em> S. typhimurium</em> Colonie batteriche che crescono all'interno dei tumori. Questo video illustra la preparazione delle cellule tumorali e l'impianto, la preparazione e l'iniezione di batteri, imaging intero animale luminescenza, l'asportazione del tumore, e la colonia batterica conteggio.
Abstract
L'obiettivo di questi esperimenti è generare dati quantitativi di andamento sulla crescita e la dinamica di espressione genica di S. attenuato typhimurium colonie batteriche che crescono all'interno dei tumori.
Abbiamo generato tumori trapiantati in topi modello per iniezione sottocutanea di una linea cellulare di carcinoma ovarico umano, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumore Repository, Frederick, MD).
Abbiamo trasformato ceppi attenuati di S. batteri typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) con una luciferasi costitutivamente espresso (luxCDABE) plasmide per la visualizzazione 2. Questi ceppi specificamente colonizzano tumori rimanendo essenzialmente non virulento al mouse 1.
Una volta tumori misurabili sono stati stabiliti, i batteri sono stati iniettati per via endovenosa attraverso la vena della coda con diversi dosaggi. Tumore localizzato, espressione del gene batterico è stata monitorata in tempo reale nel corso di 60 ore utilizzando unnel sistema di imaging in vivo (IVIS). Ad ogni tempo, i tumori sono stati asportati, omogeneizzato, e piastrate per quantificare colonie batteriche per la correlazione con i dati di espressione genica.
Insieme, questi dati produce una misura quantitativa della crescita in vivo e la dinamica di espressione genica dei batteri in crescita all'interno dei tumori.
Introduction
La biologia sintetica è progredita rapidamente nel corso degli ultimi dieci anni ed è ora posizionato a impatto dei problemi importanti nella energia e salute. Tuttavia, l'espansione in ambito clinico è stato rallentato da problemi di sicurezza e l'assenza di sviluppo di criteri di progettazione per circuiti genetici in vivo. Accelerare le applicazioni mediche di grande impatto richiede metodi che si interfacciano direttamente con infrastrutture mediche, circuiti genetici che funzionano al di fuori del setting di laboratorio controllato, e padroni di casa microbici sicuri e clinicamente accettato che utilizza.
Un numero di ceppi sono state studiate per la terapia del cancro a causa della loro capacità di crescere preferenzialmente nei tumori. Questi hanno incluso C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, e S. typhimurium 3-8. S. typhimurium ha generato particolare interesse come hanno esibito la sicurezza e la tolleranza in un certo numero di prove cliniche umane 9-12. Questi batteriologiche un stati inizialmente mostrati per creare effetti antitumorali attraverso la stimolazione del sistema immunitario dell'ospite e dalla deplezione di sostanze nutritive necessarie per il metabolismo delle cellule del cancro. Produzione di merci terapeutico è stato poi aggiunto attraverso modificazioni genetiche. Mentre questi studi rappresentano importanti progressi nell'uso di batteri per le terapie tumorali, la maggior parte degli sforzi esistenti hanno fatto affidamento su un'espressione di alto livello, che in genere si traduce nella fornitura di alti dosaggi, effetti off-target, e lo sviluppo di resistenza dell'ospite 13-16 .
Ora, la biologia sintetica può aggiungere la produzione del carico programmabile utilizzando circuiti genetici computazionalmente-progettati in grado di eseguire il rilevamento avanzate e di consegna 17-20. Questi circuiti possono essere progettati per agire come sistema di consegna che rilevano gli stimoli tumore-specifici e di auto-regolare la produzione di merci, se necessario. Tuttavia, studiando la funzione di questi circuiti in vivo è stato quindi finora impegnativo.
ve_content "> Dal plasmidi sono il quadro di riferimento comune per i circuiti sintetici, si descrive un metodo per caratterizzare la dinamica di espressione genica plasmide-based in vivo, utilizzando un modello di topo. Questi metodi utilizzano time-lapse luminescenza imaging e misurazione quantitativa di biodistribuzione. Insieme, questi approcci forniscono un quadro per studiare le reti basate plasmide in vivo per applicazioni cliniche.Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando questa procedura, siamo in grado di generare corsi di tempo per la crescita e la dinamica di espressione genica dei batteri colonizzano i tumori. Mentre queste misurazioni sono eseguite di routine in vitro in coltura batch o dispositivi microfluidici, sono molto più difficili da eseguire in vivo.
Ci sono diverse modifiche che possono essere applicate a questi metodi. Mentre abbiamo utilizzato la linea cellulare OVCAR-8 per generare nostri modelli murini, un cer…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo H. Fleming per la lettura critica e la modifica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato Misrock (TD) e NDSEG Graduate Fellowship (AP). BNS è un investigatore HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
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