신속한 Colorimetric Assays는 질적 Biomolecular 샘플에서 RNA와 DNA를 구별 할
Summary
colorimetric assays의 스위트 룸은 급속하게 구별 단백질, RNA, DNA, 그리고 잠재적으로 이기종 biomolecular 샘플에 다시 ducing 설탕에 설명되어 있습니다.
Abstract
생화학 실험은 일반적으로 잠재적 이기종 표본에 정확한 핵산의 초기 단계에서 지식,,, 단백질 및 기타 biomolecular 구성 요소가 필요합니다. 핵산이가 쉽게 구별 할 수 있지만 (예를 들어, 260), fluorometric (예, 형광 염료의 결합) 또는 colorimetric (뉴 클레오 사이드 별 chromogenic 화학 반응) 1. 분광 아르 분석 방법 등 여러 설립 방식을 통해 감지 할 수 있습니다 RNA DNA에서 260은 260 nm의 주로 280 nm의 가까이에 흡수 단백질, 근처에 주로 흡수 핵산의 상대적 내용의 간단하고 빠른이 평가를 제공으로 / A 280의 비율이 일반적으로 사용된다. 1.5 세 비율은 <순수 핵산 (NA)이 비율을 특징으로하는 동안 0.8는 '순수'단백질 표본을 나타내는로 이동합니다>.
호wever, 단백질 / NA 내용으로 명확하게하거나 안정적으로 간단한 UV-VIS 분광 측정에서 유추 할 수 없습니다있는 경우도 있습니다. 예를 들어,은 (i) 샘플 같은 일부 작은 RNA 결합 단백질의 경우는, ≈ 280 nm의 (TRP, 티르, Phe)에서 흡수에 책임이있는 향기로운 아미노산이 상대적으로 결여있는 하나 이상의 단백질을 포함하고 있습니다 (II) 샘플은 단백질 / NA 내용이 훨씬 덜 분명하다, 심지어 단백질과 NA 구성 요소 사이의 높은 친화력 협회가 반영 될 수 있습니다 중간 260 / A 280 비율을 (~ 0.8 <~ 1.5), 전시 할 수 있습니다. 이러한 시나리오의 경우, 우리는 빠르게 RNA, DNA, 그리고 분자의 잠재적 혼합 샘플에 설탕을 줄여을 구분하기 위해 본 colorimetric assays의 스위트 룸을 설명합니다. 방법은 베네딕트의에 pentoses 및 기타 탄수화물의 차동 감도에 의존 Bial의 (orcinol) 및 Dische의 (다이 페닐 아민) 시약은, 간소화 된 프로토콜은 COM 될 수 있습니다구성 요소를 분리해야하는 추가 단계없이 몇 분 만에 pleted. assays는뿐만 아니라 RNA와 DNA 사이의 구분과 같은 포도당, 과당, 그리고 리보오스 (그림 1)과 같은 무료 줄이고 설탕의 존재를 나타 내기 위해 병렬로 수행 할 수 있습니다.
Introduction
많은 세포 생물학은 DNA와 RNA를 포함하는 분자의 상호 작용을 통해 발생합니다. 4이 자연적으로 발생하는 핵산은 (NAS) (예를 들어, 이가의 양이온 단백질, 6 및 생체 내 작은 분자 화합물 및 리간드의 호스트와 함께 서로 5 상호 작용 7). 상호 작용이있을 수 있습니다 단기 또는 (kinetically) 수명이 긴, 낮은 친화력 (열역학적 힘)에 검토하기 위해 높은 곳에서 다양 할 수 있으며, 또한 화학 특성과 특이성에 상당한 변화를 전시 할 수 있습니다 – 일부 단체 (예, DNA 매우 구체적 · · · 전사 인자, RNA · · · 접합 요소), 다른 상호 작용 반드시 훨씬 더 일반적인하는 동안 (예를 들어, DNA · · · 세균 히스톤 같은 HU 단백질 8). NAS와 비 특정 상호 작용은 biomo의 혼합물을 포함하는 체외 실험에서에 대한 실질적인 결과를 가질 수lecules, 그건 일부 NAS가 적어도 사용되는 실험 조건의 일부 하위 집합 (이온 강도, 솔루션 산도 등)에 따라, 관심있는 분자와 연관 될 가능, 심지어 가능성이 있습니다.
대장균의 세포 배양에서 재조합 단백질의 heterologous 이상의 표현을 통해, 예를 들어, 관심 (POI)의 단백질의 생산을 고려, 이러한 절차는 정기적으로 거의 모든 구조 생물학 실험실에서 수행되는 구를 추가로 실험을 준비, 이러한. 생화학 / biophysical 특성, 결정 등., 초기 노력은 일반적으로 이상적인 화학적으로 균질하고 biophysically monodisperse 표본으로, 가능한 형태로 순수의 관심 장소의 충분한 수량을 확보에 주력으로. 호스트 세포의 파괴 후, 전형적인 정화 워크 플로우의 초기 단계 E.에서 관심 장소를 분리하는 것을 목표로 대장균의 단백질, 핵산, 세포 벽 파편,그리고 세포 lysate의 다른 구성 요소. 그러나, 호스트 NAS는 여러 물리 이유로 관심 장소로 공동 정화 할 수 있습니다 – 매우 기본적인 관심 장소가 아닌 특별히 풀다운 호스트 DNA / RNA 수 있으며, POI (예, 상기 HU) 일반 NA 바인딩 활동을 할 수 있습니다; POI는 호스트 RNAs 또는 DNAs있는 매우 특정 NA 결합 단백질 만 전시 교차 반응성 될 수 있으며,이 등등을하고, 호스트 NAS는 크로마토 그래피 행렬과 상호 작용함으로써 단순히 공동 elute 관심 장소로 할 수 있습니다. NA 불순물 가능성이 하류 실험 (예를 들어, POI • RNA 결합 (10)의 형광 이방성 assays)을 방해하기 때문에 관심 장소로 호스트 NAS의 무차별, 고친 화성 바인딩 애 태우게하는 문제를 야기 할 수 있습니다. 이러한 상호 작용은 POI의 핵산 결합 용량을 조명으로 또는 예기치 못한 POI는 · · · NA 협회는 또한 우연히 볼 수 있습니다. 어떤 방법을 사용하든, NAS 키 구성 요소 나 오염 물질이 있는지, 하나는 먼저 정량화해야합니다하류 실험에 대비 공동 정화 NAS의 유형을 (DNA, RNA) 확인합니다.
몇 가지 분석 방법은 감지하고 샘플에 NAS를 quantitating 존재합니다. 사용할 수있는 방법의 대부분은 (기본적으로 하나 (예를 들어, thiazole 오렌지 또는 NA에 다른 형광 염료의 결합) fluorometric (예를 들면, A 260 흡광도 값과 260 / A 280 비율) 분광, 또는 colorimetric 아르 화학 반응에 nucleosides의 민감도 전자기 스펙트럼의 UV-VIS 지역)에 흡수 항복 chromophores는 등 최근 드 현금 외 의해 설명되는 1. 그러나, RNA 또는 DNA로 폴리 뉴클레오타이드의 유형을 식별하는 중요한 단계는 다음과 quantitation의 많은의 범위를 벗어납니다 접근. 여기 빠르게 proteinaceous 샘플에서 NA 구성 요소의 유형을 식별하는 colorimetric assays의 집합을 제공합니다.
프로토콜은 여기 C를 설명이 효율적으로 잠재적 인 NA의 불순물을 분리의 추가 단계없이 실행, 그리고 (그림 1과 2) 2'-deoxypentoses의 설탕 11, pentoses 12,13의 orcinol 분석, 그리고 다이 페닐 아민 반응 14,15을 줄이기위한 베네딕트의 분석에 의존 할 수 . 베네딕트의 시험 (그림 2A)는 +, 설탕의 카르 보닐의 수반하는 산화와 같은 잘라 내기 2 O의 카르 복실 잔기 및 생산에 잘라 내기 2 감소 aldose 설탕의 선형, 오픈 체인 (알데히드) 폼의 능력을 활용 불용성 침전물 붉은 색. 이 반응은 aldoses 및 ketoses (이 enediol 중간체를 통해 해당 aldoses으로 변환) 무료로 감소 설탕 이랑 긍정적 인 테스트하지만, DNA 또는 RNA의 폴리 뉴클레오타이드의 공유 결합 백본의 일환으로 고리 형태로 고정되는 펜토 오스 설탕과. 것 무료 hemiacetal 기능의 최소한의 요구 사항, 다른 공동 때문따라서 잠재적 interferents의 역할 – -이 분석에 긍정적 인 테스트 할 수 mpounds은 α-히드 록시-ketones과 짧은 oligosaccharides (예를 들면 이당류의 말토오스)가 포함되어 있습니다. 두 Bial의 orcinol (그림 2B)와 Dische의 다이 페닐 아민 (그림 2C) 반응이 폴리 뉴클레오타이드 백본 초기 파괴에 의해 결정이되고, 뉴 클레오 사이드의 depurination 및 추가 산 또는 모 (母) 세포핵의베이스 촉매 가수 분해를 통해, 퓨란-2를 얻을 수 있도록 – carbaldehyde (푸르 푸랄 수치) 파생 상품, 이러한 파생 그런 다음 orcinol (Bial의) 또는 다이 페닐 아민 (Dische의) 대부분 알 수없는 화학 구조의 색 응축 제품을 구성하는 시약 등의 페놀 중 polyhydroxy으로 반응한다. Dische의 분석의 RNA의 특이성 대 DNA는 펜토 오스 설탕이 더 다이 페닐 아민과 반응 ω-hydroxylevulinyl 알데히드로 산화에 민감되기 위해 2'-deoxygenated해야하기 때문산성 조건 하에서 밝은 푸른 색 응축수 (그림 2C)를 얻을 수 있습니다. 여기에 설명 된 간소화 된 프로토콜을 사용하여, 우리는 이러한 설탕 특정 colorimetric 반응이 RNA와 DNA 구별 할 수 있으며, 또한 biomolecular 샘플에서 포도당, 과당, 또는 리보오스 무료로 감소 당분의 존재를 나타낼 것으로 나타났습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
colorimetric assays는 빠른 속도 등 자세한 연구를위한 준비 단백질, RNAs 또는 전체 셀 lysate에서 복합체를 정화 할 때 발생하는 등 biomolecular 혼합물의 화학 특성을 평가하기 위해 간단한 방법을 제공합니다 여기에 제시했다. 구조 생물학 이러한 샘플 이질성으로 더 네이티브처럼 어셈블리, 점진적으로 더 큰 도전을 추구으로 복잡하고 다중 구성 요소 단지로 인한 것입니다. Supramolecular 어셈블리 주…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 버지니아 대학과 Jeffress 기념 트러스트 (J-971)에 의해 재정 지원되었다. 우리는 도움이 토론과 원고의 중요한 읽기 L. 콜럼버스, K. 제인, 그리고 P. 랜돌프 감사합니다.
Materials
| Reagent or equipment | Supplier/company | Catalog number | Comments, notes |
| Anhydrous sodium carbonate | Fisher Scientific | S263 | |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | S-4641 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | VWR | VW3312-2 | |
| Orcinol monohydrate | Sigma-Aldrich | O1875 | |
| Concentrated HCl | VWR | BDH3030 | |
| Ferric chloride hexahydrate | Sigma | F-2877 | |
| Diphenylamine | Aldrich | 112763 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A28 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Ribose | Sigma | R-7500 | prep at 1% w/v in H2O |
| Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma | R6750 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C |
| Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus | Sigma | D1501 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C |
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Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety. |
Referencias
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