فحوصات اللونية السريعة للتمييز نوعيا RNA والحمض النووي في العينات البيولوجية
Summary
ووصف مجموعة من فحوصات اللونية المميزة للبروتين بسرعة، RNA، DNA، وإعادة ducing السكريات في عينات غير متجانسة الجزيئية البيولوجية المحتملة.
Abstract
التجريب البيوكيميائية عموما يتطلب معرفة دقيقة، في مرحلة مبكرة، من الحمض النووي والبروتينات، ومكونات أخرى الجزيئية البيولوجية في عينات غير متجانسة محتملة. ويمكن الكشف عن الأحماض النووية عبر العديد من الأساليب المتبعة، بما في ذلك الطرق التحليلية التي هي الطيفي (على سبيل المثال، A 260)، فلوروميتريك (على سبيل المثال، ملزمة من الأصباغ الفلورية)، أو اللونية (نوكليوزيد محددة التفاعلات الكيميائية مولد اللون) 1 على الرغم من أنه لا يمكن التمييز بسهولة RNA DNA من وA 260 / A يعمل عادة نسبة 280، كما يوفر بسيطة وسريعة 2 تقييم المحتوى النسبي للحامض النووي، التي تمتص في الغالب بالقرب من 260 نانومتر والبروتين، والتي تمتص في المقام الأول بالقرب من 280 نانومتر. نسب <تؤخذ كمؤشر إلى 0،8 'نقية' عينات البروتين، في حين يتميز الحمض النووي النقي (NA) بنسب> 1.5 3.
حويفر، وهناك سيناريوهات فيه نسبة البروتين / NA لا يمكن أن يكون كما هو واضح أو موثوق الاستدلال على ذلك من قياسات الأشعة فوق البنفسجية في مواجهة بسيطة الطيفي. على سبيل المثال، (ط) قد تحتوي على عينات واحد أو أكثر من البروتينات التي تخلو نسبيا من الأحماض الأمينية العطرية المسؤولة عن امتصاص نانومتر في 280 ≈ (TRP، صور، الفنيل ألانين)، كما هو الحال مع بعض البروتينات RNA ملزم الصغيرة، و (الثاني) يمكن أن تظهر العينات المتوسطة A 260 / A نسب 280 (~ 0.8 <~ 1.5)، حيث محتوى البروتين / NA هو أقل وضوحا بكثير، وربما حتى بعض تعكس عالية تقارب بين الجمعيات ومكونات البروتين NA. لمثل هذه السيناريوهات، ونحن هنا تصف مجموعة من فحوصات اللونية للتمييز بسرعة RNA، DNA، والحد من السكريات في عينة مختلطة من المحتمل الجزيئات الحيوية. أساليب تعتمد على حساسية من الفرق pentoses والكربوهيدرات الأخرى للبنديكت، في بيال (أورسينول)، والكواشف لDische (ثنائي فينيلامين)، ويمكن أن تكون مبسطة البروتوكولات كومpleted في غضون دقائق، من دون أي خطوات إضافية من الاضطرار إلى عزل المكونات. لا يمكن أن يؤديها في المقايسات بالتوازي للتمييز بين الحمض النووي الريبي DNA و، كذلك تشير إلى وجود السكريات المختزلة مجانا مثل الجلوكوز، والفركتوز، والريبوز (الشكل 1).
Introduction
الكثير من بيولوجيا الخلية يحدث عبر التفاعلات الجزيئية التي تنطوي على الحمض النووي RNA و.. 4 هذه الأحماض النووية التي تحدث بشكل طبيعي (ناس) تتفاعل مع بعضها البعض، 5 مع البروتينات و 6 و مع مجموعة من المركبات الصغيرة جزيء ويغاندس في الجسم الحي (على سبيل المثال، الكاتيونات ثنائي التكافؤ 7). التفاعلات قد تكون قصيرة أو طويلة الأجل (مصطلحات البحث)، قد تتراوح بين معتدلة إلى عالية لتقارب منخفضة (قوة الحرارية)، ويمكن أن تظهر أيضا اختلاف كبير في الخصائص الكيميائية والنوعية – بعض الجمعيات هي محددة جدا (على سبيل المثال، DNA · · · عوامل النسخ، RNA · · · عوامل الربط)، في حين لا تزال بعيدة التفاعلات الأخرى بالضرورة أكثر عمومية (مثل DNA · · · البكتيرية مثل البروتينات هيستون HU 8). يمكن غير محددة التفاعلات مع ناس لها عواقب عملية لتجارب المختبر في إشراك خليط من biomolecules، كما أنه من الممكن، والمحتمل حتى أن بعض الوافدين الجدد سوف تقترن مع الجزيئات الحيوية التي تهم، على الأقل في بعض فرعية من الظروف التجريبية المستخدمة (قوة الأيونية، ودرجة الحموضة الحل، الخ).
تنظر، على سبيل المثال، إنتاج بروتين من الفائدة (POI) عن طريق الإفراط في التعبير مغايرة من البروتين المؤتلف في القولونية ثقافة الخلية؛ يتم تنفيذ هذا الإجراء روتيني في مختبر البيولوجيا تقريبا أي الهيكلي 9 في الإعداد لمزيد من التجارب، من هذا القبيل. كما توصيف البيوكيميائية / البيوفيزيائية، تبلور، وما إلى ذلك، تركز الجهود الأولية عموما على الحصول على كمية كافية من POI في شكل نقي وممكن، من الناحية المثالية كعينة متجانسة كيميائيا وmonodisperse biophysically. بعد تعطيل الخلايا المضيفة، المراحل المبكرة من سير عمل نموذجية تهدف إلى تنقية عزل POI من E. البروتينات القولونية، الأحماض النووية، خلية الحطام الجدار،وغيرها من عناصر المحللة الخلوية. ومع ذلك، قد المضيف مع الوافدين الجدد POI لأسباب عدة الفيزيائية شارك تنقية– نقطة مهمة للغاية الأساسية قد غير وجه التحديد المنسدلة المضيف DNA / RNA، وPOI قد يكون لها عام NA-ملزمة النشاط (على سبيل المثال، HU المذكورة أعلاه)؛ قد يكون POI محددة إلى حد ما NA-ملزمة البروتين ولكن المعرض للتفاعل مع عبر الرناوات المضيف أو السلطات الوطنية المعينة؛ المضيف قد تتفاعل مع الوافدين الجدد مصفوفة اللوني وبالتالي ببساطة شارك في أزل مع POI، وهلم جرا. يمكن العشوائية، وارتفاع تقارب ملزم من الوافدين الجدد إلى المضيف POI تشكل مشكلة محيرة لأن الشوائب NA سوف تتداخل مع تجارب المرجح المصب (على سبيل المثال، المقايسات تباين مضان من الحمض النووي الريبي ملزمة POI • 10). بدلا من ذلك، POI غير متوقعة · · · الجمعيات NA ويمكن أيضا أن ينظر إليها مصادفة، وهذه التفاعلات لإلقاء الضوء على POI الحمض النووي ملزم القدرات. وفي كلتا الحالتين، سواء الوافدين الجدد هي المكونات الرئيسية أو الملوثات، يجب على المرء أولا وتحديدتحديد نوع (DNA، RNA) للمشاركين في تنقية ناس في التحضير للتجارب المصب.
الطرق التحليلية للكشف عن وجود عدة وquantitating ناس في عينة. معظم الطرق المتاحة هي في الأساس إما الطيفي (على سبيل المثال، قيم الامتصاصية A 260 و A 260 / A نسب 280)، فلوروميتريك (على سبيل المثال، ملزمة من البرتقال أو ثيازول الأصباغ الفلورية الأخرى إلى NA)، أو اللونية (حساسية النيوكليوسيدات إلى التفاعلات الكيميائية أن العائد chromophores امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في المنطقة في مواجهة من الطيف الكهرومغناطيسي)، كما وصفها مؤخرا وآخرون دي مي آل. 1 إلا أن الخطوة الحاسمة لتحديد نوع RNA أو عديد النوكليوتيد كما DNA خارج نطاق العديد من هذه الكميات النهج. هنا نقدم مجموعة من فحوصات لتحديد اللونية سريعا أنواع المكونات NA في عينة البروتينية.
وصف بروتوكولات هنا جيتم تنفيذها بكفاءة ودون خطوات إضافية لعزل الشوائب المحتملة NA، والاعتماد على الفحص بنديكت السادس عشر للحد من السكريات 11، الفحص أورسينول لpentoses 12،13، 14،15 وردود الفعل ثنائي فينيلامين من deoxypentoses-2'(الشكلان 1 و 2) . اختبار بنديكت السادس عشر (الشكل 2A) يستخدم قدرة النموذج، الخطي المفتوح سلسلة (ألدهيد) من السكر الدوسي للحد من النحاس 2 +، مع الأكسدة يصاحب ذلك من الكربونيل السكر في لشاردة الكاربوكسيلات وإنتاج النحاس 2 O باعتبارها راسب أحمر غير قابلة للذوبان. وهذا التفاعل الإيجابي مع خدمة اختبار السكريات المختزلة مثل aldoses وketoses (التي تحول إلى aldoses المقابلة عبر وسيطة enediol)، ولكن ليس مع السكريات البنتوز أن يتم تأمين في شكل دوري كجزء من العمود الفقري التساهمية من الحمض النووي RNA أو عديد النوكليوتيد بسبب شرط أضيق الحدود وظائف على هيمي آسيتال مجانا، وشارك أخرىmpounds التي يمكن اختبار إيجابية في هذا الاختبار – وبالتالي يكون بمثابة interferents المحتملة – تشمل α هيدروكسي الكيتونات وoligosaccharides قصيرة (مثل المالتوز ديساكهارايد). كل من في بيال أورسينول (الشكل 2B) وتستند Dische لثنائي فينيلامين (الشكل 2C) ردود الفعل على تدمير الأولي من العمود الفقري عديد النوكليوتيد، عن طريق نزع البورينات من نوكليوزيد وحمض أو مزيد المحفز القاعدة التحلل من النيوكليوتيدات الأم، لانتاج الفيوران-2 -carbaldehyde (فورفورال) مشتقات، وهذه المشتقات تتفاعل بعد ذلك مع polyhydroxy إما الفينول مثل أورسينول (في بيال) أو ثنائي فينيلامين (في Dische) الكواشف لتشكيل منتجات التكثيف الملون من التركيب الكيميائي غير معروف إلى حد كبير. الحمض النووي RNA من خصوصية مقابل الفحص وDische تنبع من حقيقة أن السكر البنتوز يجب أن تكون 2'-امؤكسج من أجل أن تكون عرضة للأكسدة لω-hydroxylevulinyl ألدهيد، الذي يتفاعل مع مزيد من ثنائي فينيلامينفي ظل الظروف الحمضية لانتاج المكثفات زرقاء زاهية (الشكل 2C). باستخدام بروتوكولات مبسطة وصفها هنا، وجدنا أن هذه التفاعلات السكر محددة اللونية يمكن التفريق بين RNA والحمض النووي، وسوف تبين أيضا وجود السكريات المختزلة مجانا مثل الجلوكوز، والفركتوز، أو الريبوز في عينة الجزيئية البيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدم المقايسات اللونية هنا نقدم مقاربة بسيطة لتقييم بسرعة الطبيعة الكيميائية للمخاليط الجزيئية البيولوجية، مثل واجهت عند تنقية البروتينات، أو المجمعات الرناوات من خلية كاملة المحللة استعدادا لمزيد من الدراسات. كما تسعى الجمعيات البيولوجيا الهيكلية أكثر الأصلي…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة فرجينيا والنصب التذكاري الاستئماني Jeffress (J-971). نشكر L. كولومبوس، جاين K.، P. راندولف ومفيدة للمناقشات والقراءة النقدية للمخطوطة.
Materials
| Reagent or equipment | Supplier/company | Catalog number | Comments, notes |
| Anhydrous sodium carbonate | Fisher Scientific | S263 | |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | S-4641 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | VWR | VW3312-2 | |
| Orcinol monohydrate | Sigma-Aldrich | O1875 | |
| Concentrated HCl | VWR | BDH3030 | |
| Ferric chloride hexahydrate | Sigma | F-2877 | |
| Diphenylamine | Aldrich | 112763 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A28 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Ribose | Sigma | R-7500 | prep at 1% w/v in H2O |
| Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma | R6750 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C |
| Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus | Sigma | D1501 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C |
|
Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety. |
Referencias
- De Mey, M., et al. Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms. Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
- Ausubel, F. M. . Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. , (1999).
- Voet, D., Voet, J. G. . Bioquímica. , (2011).
- Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. . The Biochemistry of the Nucleic Acids. , (1986).
- Rice, P. A., Correll, C. C. . Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. , (2008).
- Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).
- Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids. J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Benedict, S. R. A reagent for the detection of reducing sugars. J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).
- Endo, Y. A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism. J. Biochem. 67, 629-633 (1970).
- Almog, R., Shirey, T. L. A modified orcinol test for the specific determination of RNA. Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).
- Dische, Z. New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).
- Burton, K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid. Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).
- Vogel, J., Luisi, B. F. Hfq and its constellation of RNA. Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).
- Deckert, J., et al. Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions. Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).
- Stevens, S. W., et al. Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP. Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).
- Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
