Optogenetic Activering van zebravis Somatosensorische Neuronen met chef-tdTomato
Summary
Optogenetic technieken het mogelijk gemaakt om de bijdrage van specifieke neuronen te bestuderen. We beschrijven een werkwijze voor het activeren larvale zebravis enkele somatosensorische neuronen die een channelrhodopsin variant (CHEF) met een diode-gepompte vaste stof (DPSS) laser en registreren van gedrag opgewekt met een hoge snelheid video camera.
Abstract
Larvale zebravis zijn in opkomst als een model voor het beschrijven van de ontwikkeling en functie van eenvoudige neurale circuits. Vanwege hun externe bevruchting, snelle ontwikkeling en doorschijnendheid zijn zebravis bijzonder geschikt voor optogenetic benaderingen neurale circuitfunctie onderzoeken. In deze benadering worden lichtgevoelige ionenkanalen uitgedrukt in specifieke neuronen, waardoor de experimentator te activeren of te remmen op en zal derhalve evalueren hun bijdrage aan specifiek gedrag. Het toepassen van deze methoden in larvale zebravis is conceptueel eenvoudig, maar vereist de optimalisatie van de technische details. Hier tonen een procedure voor het tot expressie channelrhodopsin een variant in larvale zebravis somatosensorische neuronen, foto-activerende afzonderlijke cellen en het registreren van de resulterende gedrag. Door enkele wijzigingen eerder vastgestelde werkwijzen, kan deze benadering worden gebruikt om gedragsreacties ontlokken enkele neuronen geactiveerd uptot minstens 4 dagen na de bevruchting (DPF). Concreet hebben we een transgen met behulp van een somatosensorische neuron versterker, CREST3, om de uitdrukking van de gelabelde channelrhodopsin variant, chef-tdTomato rijden. Injecteren van deze transgen in 1-cel embryo's resulteert in mozaïek expressie in somatosensorische neuronen, die kunnen worden afgebeeld met confocale microscopie. Illuminating geïdentificeerd cellen in deze dieren met licht van een 473 nm laser DPSS, geleid door een glasvezelkabel, ontlokt gedrag dat kan worden opgenomen met een high-speed video camera en geanalyseerd kwantitatief. Deze techniek kan worden aangepast aan studie gedrag opgewekt door activeren van een zebravis neuron. De combinatie van deze aanpak met genetische of farmacologische storingen zal een krachtige manier om circuit vorming en functie te onderzoeken zijn.
Introduction
De ontwikkeling van optogenetic methoden voor het bevorderen of remmen van neuronale prikkelbaarheid met bepaalde golflengten is het mogelijk de functie van verschillende populaties van neuronen in neurale circuits controle gedrag 1, 19, 21 bestuderen. Deze techniek wordt vaak gebruikt om groepen van neuronen activeren, maar kan ook worden gebruikt om individuele neuronen activeren. Zebravis larven bijzonder vatbaar voor deze methoden omdat zij translucent, het zenuwstelsel ontwikkelt zich snel en het creëren van transgene dieren is snel en routine. Moet echter aanzienlijke technische obstakels worden overwonnen om betrouwbaar bereiken enkel neuron activatie.
Om een procedure voor optogenetic activering van enkele zebravis neuronen te optimaliseren, hebben we ons gericht op somatosensorische neuronen. Zebravis larven detecteren verschillende somatosensorische stimuli met twee populaties van neuronen: trigeminale neuronen, die het hoofd innerveren en ROHON-Beard (RB) neuronen, die de rest van het lichaam innerveren. Elke trigeminus en RB neuron projecteert een perifere axon die takken op grote schaal in de huid op prikkels en een centrale axon die verbinding maakt met downstream neurale circuits op te sporen. Dieren reageren op zo vroeg 21 uur na de bevruchting (HPF) aan te raken, wat aangeeft dat coherente somatosensorische circuits zijn 5 gevormd, 18. Tijdens de larvale ontwikkeling tenminste een driehoeks-en RB neuronen synaps op de Mauthner cel klassieke escape reacties activeren, maar geaccumuleerd bewijs suggereert dat er meerdere klassen van somatosensorische neuronen met verschillende patronen van verbindingen die opwekken variaties op de vluchtgedrag 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. De motivatie voor het ontwikkelen van deze werkwijze was het gedrag functie van verschillende klassen van somatosensorische neuronen karakteriseren, maar deze benadering kan in principe worden gebruikt om de functie van vrijwel elk neuron of populatie van neuronen in lar bestuderenval zebravis.
Douglass et al.. Eerder beschreven een werkwijze voor het activeren Channelrhodopsin-2-expressie somatosensorische neuronen met blauw licht opwekken vluchtgedrag 3. Hun aanpak gebruikt een versterker element van de isl1 gen tot expressie van ChR2-EYFP rijden somatosensorische neuronen. Dit transgen werd echter gemeld relatief zwakke fluorescentie weergegeven, waarbij co-injectie van het reporter te UAS :: GFP, zodat visualisatie van cellen die ChR2-EYFP. Deze benadering werd gebruikt om het gedrag van responsen op te wekken tussen de 24 tot 48 hpf, maar kon nooit een reactie uitlokken Afgelopen 72 hpf. Terwijl deze methode werkt voor het bestuderen neurale circuits in zeer vroege larvale stadia (24-48 HPF) is onvoldoende voor het karakteriseren neurale circuits en gedragsreacties in oudere larven, wanneer meer diverse gedragsreacties duidelijk zijn en neurale circuits rijper.
We zochten naarverbetering van de gevoeligheid van deze techniek om de functie van subpopulaties van neuronen larvale RB karakteriseren. Om expressie verbeteren we een somatosensorische-specifieke enhancer (CREST3) 20 tot expressie van LexA-VP16 en een gedeelte van LexA operatorsequenties (4xLexAop) 11 rijden naar de expressie van een fluorescent gelabeld licht geactiveerde kanaal amplificeren. Deze configuratie versterkte expressie van het kanaal, waardoor de noodzaak voor co-expressie van een tweede verslaggever en waardoor we de relatieve overvloed van het kanaal direct te bepalen in elk neuron. Met de LexA / LexAop sequentie hadden een bijkomende voordeel dat wij het transgen te introduceren in zebravis reporter lijnen die de Gal4/UAS systeem. Tijdelijke expressie van deze transgene resulteerde in variërende niveaus van expressie, maar was gewoonlijk sterk genoeg om zowel het cellichaam en axonale projecties van individuele neuronen te visualiseren gedurende meerdere dagen. Om handschoe optimaliserenheid aan het licht dat we het gebruikte licht geactiveerde kanaal chef-kok, een channelrhodopsin variant bestaat uit een hersenschim van channelopsin-1 (Chop1) en channelopsin-2 (Chop2) met een crossover site op helix-lus EF 13. Dit kanaal wordt geactiveerd op dezelfde golflengte als ChR2, maar vereist lagere lichtintensiteit voor activering, waardoor het gevoeliger dan andere veelgebruikte kanalen, waaronder ChR2. De chef-kok eiwit werd gefuseerd met het rode fluorescerende eiwit, tdTomato, waardoor we voor eiwitexpressie scherm zonder het activeren van het kanaal. Als lichtbron, gebruikten we een diode gepompte solid-state (DPSS) laser gekoppeld met een glasvezelkabel aan een nauwkeurige, krachtige puls van blauw licht leveren aan een specifiek gebied van de larven. Dit liet ons toe laserlicht gericht op individuele neuronen, waardoor de noodzaak voor het vinden van zeldzame transgene dieren die het kanaal in een neuron. Met behulp van deze aanpak zijn we in staat waren om een RB neuronen te activeren, gedrags-respons op te nemens met een hoge snelheid video camera en beeld de geactiveerde neuronen hoge resolutie met confocale microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben beschreven een aanpak voor optogenetic activering van een RB neuronen in levende zebravis. Onze methode maakt gebruik van voorbijgaande transgenese een fluorescent gelabeld channelrhodopsin variant, chef-tdTomato 13, uit te drukken in specifieke somatosensorische neuronen. Deze benadering kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik in andere larvale zebravis celpopulaties.
Met deze aanpak hebben we consequent gedragsreacties opgewekt 34-48 hpf larven uiten chef-tdTomato….
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Fumi Kubo, Tod Thiele en HerwigBaier (UCSF / Max Planck Instituut) om advies over het gedrag van experimenten en DPSS laser ingesteld; Heesoo Kim en Chiara Cerri uit de MBL Neurobiologie cursus om te helpen bij Chef-tdTomato experimenten; PetronellaKettunen (Universiteit van Göteborg ) voor de eerste samenwerking op het optogenetic experimenten; bouwen en Roger Tsien (UCSD) voor de chef-tdTomato; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca en John Milligan (UCLA) voor technisch advies. Dit werk werd ondersteund door een NRSA (5F31NS064817) gunning aan AMSP en een subsidie van de NSF (RIG: 0819010) naar AS.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100×15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60×15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
Referencias
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
- Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
- Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
- Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
- Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
- Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
- Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
