Attivazione Optogenetic di zebrafish neuroni somatosensoriali con Chef-tdTomato

Lo sviluppo di metodi optogenetic per promuovere o inibire l'eccitabilità neuronale con lunghezze d'onda definite di luce ha permesso di studiare la funzione di distinte popolazioni di neuroni nei circuiti neurali che controllano il comportamento ^{1, 19, 21.} Questa tecnica viene spesso utilizzato per attivare gruppi di neuroni, ma può anche essere utilizzato per attivare i singoli neuroni. Larve Zebrafish sono particolarmente suscettibili di questi metodi in quanto sono trasparenti, il loro sistema nervoso si sviluppa rapidamente, e la creazione di animali transgenici è veloce e di routine. Tuttavia, notevoli ostacoli tecnici da superare per ottenere l'attivazione affidabile singolo neurone.

Per ottimizzare la procedura per l'attivazione dei neuroni optogenetic zebrafish singoli, ci siamo concentrati sui neuroni somatosensoriali. Larve Zebrafish rilevare una varietà di stimoli somatosensoriali con due popolazioni di neuroni: i neuroni del trigemino, che innervano la testa, e ROHON-Beard (Rb) neuroni che innervano il resto del corpo. Ogni neurone trigeminale e RB proietta un assone periferico che si dirama lungo in pelle di individuare stimoli e un assone centrale che si connette a valle circuiti neurali. Animali risponde al tocco Già il 21 ore post-fecondazione (HPF), indicando che i circuiti coerenti somatosensoriali si sono formati ^{5, 18.} Durante lo sviluppo larvale, almeno un po 'di sinapsi del trigemino e RB neuroni sulla cellula di Mauthner di attivare risposte di fuga classici, ma accumulando evidenza suggerisce che ci sono più classi di neuroni somatosensoriali con diversi modelli di connettività che possono suscitare variazioni sul comportamento di fuga ^{2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17.} La motivazione per lo sviluppo di questo metodo è di caratterizzare la funzione del comportamento di diverse classi di neuroni somatosensoriali, ma questo approccio potrebbe in linea di principio essere usato per studiare la funzione del neurone o qualsiasi popolazione di neuroni in larval zebrafish.

Douglass et al. Precedentemente descritto un metodo per l'attivazione channelrhodopsin-2-esprimono neuroni somatosensoriali con luce blu, suscitando comportamento di fuga ^3. Il loro approccio utilizzato un elemento enhancer del gene isl1 per guidare l'espressione di CHR2-EYFP nei neuroni somatosensoriali. Questo transgene, tuttavia, è stato segnalato per visualizzare fluorescenza relativamente debole, richiedendo co-iniezione di un secondo reporter, UAS :: GFP, per permettere la visualizzazione di cellule esprimenti CHR2-EYFP. Questo approccio è stato utilizzato per ottenere risposte comportamentali tra 24-48 HPF, ma non potrebbe mai ottenere una risposta Dopo 72 HPF. Così, mentre questo metodo funziona per studiare circuiti neurali nelle fasi larvali molto precoci (24-48 HPF), è inadeguato per la caratterizzazione di circuiti neurali e le risposte comportamentali in età superiore larve, quando più risposte diverse comportamentali sono evidenti e circuiti neurali sono più maturi.

Abbiamo cercato dimigliorare la sensibilità di questa tecnica per caratterizzare la funzione delle sottopopolazioni di neuroni RB larvali. Per migliorare l'espressione abbiamo utilizzato un somatosensoriale-specifico enhancer (CREST3) ²⁰ per guidare l'espressione di LexA-VP16 e un tratto di sequenze operatore lexA (4xLexAop) ¹¹ per amplificare l'espressione di una fluorescenza etichettato fotoattivabile canale. Questa configurazione amplificato espressione del canale, eliminando la necessità di co-esprimere un secondo reporter e che ci permette di determinare direttamente l'abbondanza relativa del canale in ogni neurone. Utilizzando il LexA / LexAop sequenza avuto l'ulteriore vantaggio di consentire di introdurre il transgene in linee reporter di zebrafish che utilizzano il sistema Gal4/UAS. Espressione transitoria di questo transgene portato a diversi livelli di espressione, ma di solito era abbastanza robusto per visualizzare sia il corpo cellulare e le proiezioni assonali dei singoli neuroni per diversi giorni. Per ottimizzare la sensibilitàlità alla luce abbiamo usato la luce attivata canale chef, una variante channelrhodopsin costituito da una chimera di channelopsin-1 (Chop1) e channelopsin-2 (Chop2) con un sito di crossover a elica ciclo EF ^13. Questo canale è attivato alla stessa lunghezza d'onda CHR2, ma richiede una minore intensità di luce per l'attivazione, il che rende più sensibili di altri canali comunemente utilizzati, compresi CHR2. La proteina chef era fusa alla proteina fluorescente rossa, tdTomato, che ci permette di selezionare per l'espressione della proteina senza attivare il canale. Come sorgente luminosa, abbiamo utilizzato un diodo pompato a stato solido (DPSS) laser accoppiato ad un cavo in fibra ottica per fornire una precisa, potente impulso di luce blu per una regione specifica delle larve. Questo ha permesso di concentrare la luce laser sui neuroni individuali, eliminando la necessità di trovare rare animali transgenici che esprimono il canale in un singolo neurone. Usando questo approccio, siamo stati in grado di attivare i neuroni RB singoli, registrare risposta comportamentales con una telecamera ad alta velocità video e immagine i neuroni attivati ​​ad alta risoluzione con microscopia confocale.