本报告中的调查结果和结论是这些作者的观点,并不一定代表美国疾病控制和预防中心的意见。
气道上皮细胞的顶端和基底表面展示了接触病原体在体内的定向反应。因此,理想的体外模型研究细胞对呼吸道病原体的分化,形成心尖和基底表面。这样的模式是有区别的正常人类支气管上皮细胞(NHBE)。然而,这种系统需要肺组织样本,专业知识分离和培养从组织中的上皮细胞,和时间,以产生一个空气 – 液体界面的文化。
CALU-3细胞,来自一个人支气管腺癌,是研究近端呼吸道上皮细胞的响应呼吸侮辱1,药理化合物2-6,和7-9的细菌和病毒病原体的,包括流感病毒,鼻病毒的替代模式与严重急性呼吸系统综合症-相关的冠状10-14。最近,WE展现CALU-3细胞很容易受到呼吸道合胞病毒(RSV)感染在与NHBE 15,16一致的方式。在这里,我们建立了详细的极化,覆盖的液体培养的CALU-3细胞(LCC),专注于成长和培养CALU-3细胞,维持细胞已被培养成LCC的技术细节,我们提出了用于执行呼吸偏振光CALU-3细胞中的病毒感染的方法。
为了持续获得极化CALU-3 LCC,,CALU-3细胞必须小心传代培养前在Transwell小室。 CALU-3单层培养应保持在90%以下汇合,从冻结的股票应少于10次传代培养,并应定期提供新鲜培养基。一旦培养在Transwell小室内,CALU-3,LCC,必须小心处理。不规则的介质的变化和细胞层或板的机械或物理中断产生负面影响偏振几个小时或几天。极化评估反上皮的电阻(TEER)监测和评估的被动之间的平衡,荧光素钠的顶端和基底车厢17,18验证。一旦TEER在或1,000Ω×2厘米以上的高原,CALU-3 LCC是准备用来检查细胞对呼吸道病原体。
当建立CALU-3中的LCC的Transwell小室的细胞可能不极化在所有,或可能不完全分化,定义由TEER≥1,000Ω×cm 2和≤1%荧光素钠染料心尖和基底舱室之间达到平衡。此外,在LCC的CALU-3细胞可以充分分化,但,TEER可能是不一致的测量之间的。虽然从日常的TEER的测量的CALU-3 LCC的波动是正常的,一旦完全偏振光,TEER的剧烈波动没有预计到的文化自然随着年龄的下降,这可能是短短的5个星期或长达12周后播种。
CALU-3 LCC极化的能力部分地取决于细胞如何维持并传代培养在Transwell小室系统使用前。超出90%汇合的单层生长的细胞,具有在传代培养过程中,已传代培养从冷冻库存中的10倍以上,或没有连接提供一个定期的新鲜培养基上是不太可能完全分化,并,任何两极分化很可能迅速下降。也可能是由于不完整或完全没有极化使用的CALU-3 LCC的Transwell小室内的材料和孔径的变化,和很多很多类似的组成和孔径的Transwell小室内的变化也可能会影响极化。较大的孔径大小可以让CALU增长通过Transwell小室膜到基底外侧室,防止文化偏光。偏振情况下也可能是由于细菌的生长,表明云培养基,从而导致随后的崩溃CALU-3细胞之间的紧密连接。
可变TEER测量CALU-3 LCC的原因可能是由机械CALU-3 LCC细胞单层,插入,或在板本身的中断。中的变化和TEER测量应不吸头或电DE导致接触的细胞。在执行这些操作时,应注意避免气泡进入的顶端和基底室,这将破坏的能力,以检测电阻的voltohmmeter。可能也限制了蛋白质积聚在电极引线的能力voltohmmeter检测电阻的文化,实际上是极化。此积聚可轻轻打磨除去,或者可以通过更换电极校正。
一旦CALU-3 LCC完全分化和TEER不再增加,CALU-3 LCC是准备用于在主机肺上皮细胞的反应,呼吸道感染为特征的体外模型。该系统能够更好地表征方向的反应相比,传统上用来研究呼吸道病原体,如A549和HEp-2细胞的单层培养的肺癌细胞株的病原体,CALU-3 LCC北额外的优点纳克更快速的发展,越来越容易获得,并且不太昂贵的产生不是主要的,两极化,差异化的NHBE。 NHBE,极化CALU-3表现出紧密连接形成,并产生粘蛋白。然而,不像NHBE,偏振光CALU-3细胞不分化成层的基底细胞和纤毛柱状上皮细胞,以及几偏振光CALU-3细胞培养纤毛状突起19。因此,尽管用于研究极化反应的呼吸道上皮细胞呼吸侮辱,偏光CALU-3 LCC是不是一个理想的模型来研究气道呼吸的侮辱和伤害的开发或改造。 体外培养细胞的粘液生产可能会影响细胞的感染性,感染病毒和病毒传播中的极化模型以及释放,极化CALU LCC和两极化,差异化的NHBE尚未见报道的粘液生产之间的直接比较。 A549和HEp-2细胞重新较易培养比CALU-3细胞,然而,不像CALU-3 LCC,它们不形成偏振光文化Transwell小室上生长时, 在体外研究极化上皮细胞呼吸道病毒感染的响应,并因此是不理想的模型。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢伊丽莎白·布兰查德对她的技术援助。本报告中的调查结果和结论是这些作者的观点,并不一定代表美国疾病控制和预防中心的意见。
REAGENTS | |||
Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
0.05% Trypsin – 0.02% EDTA | Gibco/Invitrogen | 25300 | |
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Gibco/Invitrogen | 07-00100DK | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30070.03 | Heat-inactivate, 56 °C, 30 mins |
Non-essential amino acids 100X (10 mM) | Gibco/Invitrogen | 11140 | Store at 4 °C in the dark |
L-glutamine | Gibco/Invitrogen | 25030 | |
HEPES | Gibco/Invitrogen | 15630 | |
EMEM-10% FBS (EMEM-10%) | Supplement EMEM with heat-inactivated FBS to 10% serum, sterile-filter | ||
EMEM-20% FBS + supplements (EMEM-20%+S) | Supplement EMEM to final concentrations: heat-inactivated FBS, 20%; 1X amino acids; 2 mM L-glutamine; 10 mM HEPES; sterile-filter | ||
24-well Transwell plates | Corning Costar | 3472 | 3 μm pore size, polyester |
Trypan blue | Gibco/Invitrogen | 15250 | |
Ethanol | Sigma | E7023 | Prepare to 70% using sterile dH2O |
Dulbecco’s PBS (D-PBS) | Invitrogen | 14040 | |
Non-fluorescent buffer | 118 mM NaCl; 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2×H2O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 in sterile water; sterile-filter | ||
Sodium fluorescein | Sigma | 6377 | 1 mg/ml in sterile non-fluorescent buffer; sterile-filter, protect from light; store at 4 °C up to 6 months |
EQUIPMENT | |||
Voltohmmeter | World Precision Instruments | ||
STX2 electrode | World Precision Instruments | ||
ELISA plate reader | Capable of measuring A486 or A490 |