Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell'ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em> In vitro</em

1. Colture Calu-3 celle per l'uso in Culture Transwell Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza con tecnica sterile cultura. Per scongelare le cellule di congelazione: Preparare terreno minimo essenziale di Eagle contenente 20% di siero di siero bovino fetale (FBS), 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 2 mM L-glutammina, e 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Sterile-filtro il terreno preparato con un 0,2 micron pori grandezza del filtro, e caldo in un bagno d'acqua a 37 ° C. Per essere più riflettente del contesto in situ epitelio delle vie aeree, mezzo non è integrato con antibiotici o antimicotici. Scongelare una provetta Microbank ™ congelata di Calu-3 celle rapidamente (<1 min) a 37 ° C bagnomaria. Trasferire le cellule scongelate in una provetta da 50 ml conica sterile ed aggiungere 30 ml di caldo EMEM-20% + S. Pellet le cellule mediante centrifugazione per 5 minuti a 1000-1200 × g,senza refrigerazione, con velocità e freni. Decantare il surnatante delicatamente e risospendere le cellule in 5 ml di caldo EMEM-20% + S delicatamente pipettando su e giù. Seed 2 a 5 x 10 6 cellule per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti di coltura e incubare a 37 ° C, 7% CO 2 in atmosfera di aria fino a quando le cellule sono del 75% – 80% confluenti. Controllare tutti i giorni, fino a 7 giorni può essere richiesto. Ogni 3-4 giorni aspirare il terreno dalle cellule e sostituirlo con fresco EMEM-20% + S. Per celle sottocultura: Caldo tripsina 0,05% – 0,02% EDTA in un bagno d'acqua a 37 ° C. Aspirare il terreno dalle cellule, cellule e lavare una volta con riscaldata tripsina 0,05% – 0,02% EDTA per rimuovere eccesso di terreno e siero. Rimuovere il lavaggio e aggiungere 1 ml di tripsina riscaldato per pozzetto alle cellule. Incubare a 37 ° C e il 7% di CO 2 e monitor al microscopio ogni 5 min fino ad almeno il 75% delle cellule staccare dal pozzo (s) della piastra di coltura tissutale. Questo puòprendere tra 5 e 30 minuti. Lavare le cellule in EMEM-20% + S per rimuovere l'eccesso tripsina. Trasferire le cellule tripsinizzate in una provetta conica da 50 ml sterile. Più pozzetti di cellule da una piastra da 6 pozzetti coltura possono essere raggruppati in un unico tubo da 50 ml conica sterile. Aggiungere 30 ml di EMEM-20% + S e agglomerare le cellule per centrifugazione a 1000-1200 × g, senza refrigerazione, con velocità e freni. Decantare il surnatante delicatamente e risospendere le cellule in fresco EMEM-20% + S pipettando gentilmente su e giù. Utilizzando i passaggi attraverso 1.2.1 1.2.3 qui sopra per Tripsinizzare cellule, le cellule continuano a sottocultura in piatti di coltura di tessuti come descritto nei punti 1.2.5 tramite 1.2.7 quando sono tra il 75 – 80% confluenti. Subcoltura da un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti fino ad un T-25 cm 2 beuta in un volume finale di 5 ml di EMEM-20% + S, semina tra 0,5 a 1 x 10 6 cellule / fiasco. Con 5 ml di tripsina riscaldato per T-25 cm 2 pallone per staccare le cellule, subculturada un T-25 cm 2 pallone a uno T-75 cm 2 pallone in un volume finale di 10 ml di EMEM-20% + S, semina da 1 a 5 x 10 6 cellule / fiasco. Utilizzo di 8 ml riscaldato tripsina per T-75 cm 2 pallone per staccare le cellule, sottocultura da un T-75 2 cm pallone in 2 T-75 cm 2 palloni. Per la crescita cellulare ottimale, non subcoltura cellule in fiasche grandi di T-75 cm 2 o subcultura ad un rapporto maggiore di 1 pallone genitore: 3 flaconi nuovi. Una volta che le cellule sono state subcolturate completamente rimuovere e sostituire medio ogni 2 o 3 giorni fino a raggiungere 75-90% di confluenza. Le cellule possono richiedere fino a 3 settimane per raggiungere il 75-90% confluenza. Per la generazione ottimale di culture polarizzati, cellule sottocultura prima di crescere oltre il 90% di confluenza in un monostrato. Continuare a cellule sottocultura finché le cellule sono cresciute abbastanza per inizializzare il numero desiderato di inserti Transwell. Ogni inserto Transwell richiede 2 × 10 5 cellule. Per prestazioni ottimali generando culture polarizzate, utilizzare cellule che hanno subito non più di 10 sottoculture. 2. Growing polarizzati Calu-3 Liquido coperte di Culture (LCC) Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza con tecnica sterile cultura. Preparare EMEM contenente 10% FBS (EMEM-10%) e caldo in un bagno d'acqua a 37 ° C. Preparare un 24-pozzetti Transwell per la semina. Utilizzando pinze sterili, spostare inserisce Transwell dall'interno alle righe esterne della piastra senza toccare la membrana di inserimento. Cellule devono essere subcoltivate in pozzetti sulle righe esterne della piastra. Per evitare la formazione di bolle d'aria all'interno del vano basolaterali, aggiungere 600 microlitri di EMEM-10% a ciascuno inclinando la pipetta contro la parete di ciascun vano e rilasciando lentamente il mezzo nel pozzo. Staccare le cellule di T-75 cm 2 tessuti. Subcufiaschi lture utilizzando tripsina riscaldato, e lavare in 30 ml di EMEM-20% + S per ogni 2 fiaschi di cellule tripsinizzate, come descritto al punto 1.2. Accuratamente risospendere le cellule lavate in 5 ml di EMEM-10% delicatamente pipettando su e giù. Determinare conteggio delle cellule vitali e totale con il metodo di esclusione trypan blu. Procedere solo se l'80% – 90% sono vitali. In una provetta conica da 50 ml sterile, diluire cellule ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule vitali / ml con EMEM-10%. Aggiungere celle al compartimento apicale di ogni Transwell. Per pozzetti A1 e D1, che saranno privi di cellule pozzetti di controllo, che è, spazi, aggiungere 100 microlitri di EMEM-10% senza cellule. A ciascuno dei rimanenti pozzetti, aggiungere 100 microlitri di sedimento Calu-3 celle, delicatamente inclinando la pipetta contro il canale di guida interno della parete dell'inserto e rilasciando lentamente le cellule. Non toccare la pipetta alla membrana inserto. Per mantenere una sospensione omogenea di cellule Calu-3, agitare delicatamente la sospensione cellularedurante questa fase semina. Transwell incubare a 37 ° C e il 7% di CO 2 in atmosfera di aria. Collocare la piastra in un incubatore dove disturbo fisico sarà minimo. Per migliorare l'efficienza di polarizzazione, non impilare piatti uno sopra l'altro. Per mantenere culture fino polarizzata e pronto per l'uso in esperimenti, sostituire completamente medie Transwells, come descritto nei passaggi 2,10 a 2.13 di seguito. Terreno deve essere completamente sostituita tre giorni dopo essere subcoltura in Transwells, e quindi su un ciclo alternato tra il quarto giorno e poi terzo dopo la somministrazione precedente, finché le cellule sono completamente polarizzati. Caldo EMEM-10% in un bagno d'acqua a 37 ° C. Aspirare delicatamente media da inserti Transwell. Con una pipetta capillare collegato ad una trappola vuoto con un vuoto dolce, o con una pipetta da 1 ml, medie aspirato da cell-free pozzetti A1 e D1, poi da seeded pozzi, prima di rimuovere medio apicale da tutti i pozzetti, e tgallina rimozione media basolaterale da tutti i pozzetti. Non toccare le membrane inserti mentre aspirazione media. Aggiungere 200 pl di EMEM-10% al compartimento apicale del cell-free pozzetti A1 e D1, quindi ai pozzetti seminato, dirigendo il mezzo nel vano apicale usando il lato dell'inserto per guidare la punta della pipetta. Non aggiungere mezzo direttamente su cellule, e non toccare la membrana di inserimento. Aggiungere 600 pl di EMEM-10% ai compartimenti basolaterali. Per evitare la formazione di bolle d'aria all'interno del vano basolaterali, aggiungere mezzo a ciascuno inclinando la pipetta contro la parete di ciascun vano e rilasciando lentamente il mezzo nel pozzo. 3. Valutare lo sviluppo di resistenza di Calu-3 LCC Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza con tecnica sterile cultura. Valutare trans-epiteliale resistenza elettrica (TEER) di Calu-3 LCC 30 minuti dopocambia il supporto, la valutazione può essere eseguita dopo ogni cambio di mezzo se lo si desidera. Eseguire misure in condizioni sterili. Inizia misure con il cell-free dei pozzetti di controllo A1 e D1 (le frasi) per ottenere misurazioni di base, e proseguire con le misurazioni per ciascun pozzetto. In condizioni di sterilità, trasferire l'elettrodo Stx2 un tubo da centrifuga da 50 ml contenente 70% di etanolo in acqua sterile, e sterilizzare 15 min. Calibrare e provare il voltohmmeter per l'uso secondo le istruzioni del produttore. Rimuovere l'elettrodo dal etanolo, aria secca sec 5-10, e sciacquare l'elettrodo con sterile EMEM-10%. Impostare il selettore di modalità del voltohmmeter per l'impostazione della resistenza, e accendere l'unità. Posizionare delicatamente l'elettrodo in una delle tre porte che permettono l'accesso al vano basolaterale di una cultura Transwell. Elettrodo posto in modo che la portano più solo leggermente tocca il fondo del pozzo esterno e rimane verticale,e il terminale corto è nel mezzo di coltura tissutale del compartimento apicale, senza toccare la membrana inserto. Premere "Misura R" pulsante e attendere che la lettura si stabilizzi. Ripetere per le altre due porte per ciascun pozzetto e registrare le misure da tutte e tre porte, per un totale di tre misurazioni per pozzetto. Continuare a misurare la resistenza per tutti i pozzetti di cellule. Pulire l'elettrodo immergendolo 5-10 minuti in etanolo al 70%, risciacquo in sterile dH 2 O, e asciugatura accuratamente. Conservare nel contenitore originale. Calcolare la resistenza di ogni pozzetto, con l'equazione 1. Ω = Ω attuale campione – Ω bianco, l'equazione 1 cui il campione Ω è la misura media da un pozzo privato dei semi e Ω bianco è la misura media dei pozzi 2, A1 e D1, contenenti inserti e medie, ma non le cellule. Calcolare la resistenza unità di superficie, usando Equazione 2. Ω × area effettiva della membrana effettiva = Ω × cm 2, l'equazione 2 in cui l'area effettiva della membrana è 0,33 cm 2 per 24 pozzetti inserti Transwell. Verificare che la polarizzazione è completa eseguendo un test secondario, che misura la diffusione passiva fluoresceina di sodio tra i compartimenti apicale e basolaterale, sul 1-3 culture Transwell. I pozzetti di siero umano fluoresceina di sodio deve essere eliminata immediatamente dopo il completamento del test. Preparare non fluorescente tampone (118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl 2 .2 H 2 O, 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 in acqua sterile; filtro sterile con 0,45 micron dispositivo di filtrazione ). Preparare fluoresceina di sodio a 1 mg / ml in tampone non fluorescente, filtro sterile, avvolgerlo in un foglio di alluminio, e conservare a 4 ° C, al riparo dalla luce. Riscaldare a temperature ambientenuovamente prima dell'uso. Dopo aver completato misure di resistenza, rimuovere accuratamente medio da entrambi i compartimenti basolaterali e apicale di 1-3 singole culture Transwell. Sciacquare culture Transwell. Delicatamente aggiungere 600 microlitri temperatura ambiente sterile PBS di Dulbecco (D-PBS) ai compartimenti basolaterali e 100 pl temperatura ambiente sterile D-PBS ai compartimenti apicali. Rimuovere delicatamente D-PBS dai pozzi. Aggiungere 600 microlitri sterile non fluorescente tampone ai vani basolaterali. Aggiungere 100 pl sterile 1 mg / ml di sodio fluoresceina ai compartimenti apicali. Incubare la piastra a 37 ° C per 1 ora. CO 2 non è richiesto durante l'incubazione. Durante l'incubazione, preparare una curva standard di sodio fluoresceina compresa tra 20 mg / ml e 0 microgrammi / ml, utilizzando non fluorescente tampone per diluire fluoresceina di sodio. Preparare almeno 8 diverse concentrazioni di sodio fluoresceina, ciascuna in un volume finale di almeno 600 microlitri. Mantenerediluizioni della curva standard al riparo dalla luce fino al momento di misurare l'assorbanza. Trasferire il campione non fluorescente tampone dal vano basolaterale di ogni Transwell test per un tubo separato pulito per l'analisi. Rimuovere il test Transwells utilizzato per esaminare diffusione passiva fluoresceina di sodio dalla piastra e scartare. Riportare la piastra con Transwells restanti l'incubatrice. Mettere 100 ml di ciascuna soluzione standard in triplice copia in una da 96 pozzetti a fondo piatto piatto. Preparare tre diluizioni di ciascun campione basolaterale (1:02, 1:20 e 1:50) in non-fluorescente tampone, e aggiungere 100 ml di ciascun campione diluito e di ogni diluizione, in duplice copia, in un 96-ben piatto piastra inferiore. Misura assorbanza del campione su un lettore di piastre ELISA a 486 nm o 490 nm. Determinare la concentrazione di sodio fluoresceina nel vano basolaterale confrontando l'assorbanza dei campioni con i valori di assorbanza per il sodio fluoresceina stcurva Andard. 4. Infezione polarizzata Calu-3 LCC con Virus Respiratorio Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza utilizzando una tecnica sterile cultura, ad un livello adeguato di biosicurezza per il virus in uso. Diluire virus nel siero privo EMEM modo che inoculi desiderata sarebbe in 100 pl. Lavare le cellule nel siero senza EMEM. Aspirare delicatamente media da tutti i pozzetti, rimuovere il mezzo apicale poi il mezzo basolaterale. Con una pipetta capillare collegato ad una trappola vuoto con un vuoto dolce, o con una pipetta da 1 ml, medie aspirato da cell-free pozzetti A1 e D1, poi da seeded pozzi, prima rimuovere il mezzo apicale da tutti i pozzetti, e quindi rimuovendo il mezzo basolaterale da tutti i pozzetti. Non toccare le membrane inserti mentre aspirazione media. Aggiungere 100 pl di siero privo EMEM al compartimento apicale del cell-free pozzetti A1 e D1, e quindi tegli seeded pozzi, dirigendo medie nel vano apicale usando il lato dell'inserto per guidare la punta della pipetta. Non aggiungere mezzo direttamente sulle cellule, e non toccare la membrana di inserimento. Aggiungere 600 microlitri di siero privo EMEM ai compartimenti basolaterali. Aggiungere mezzo a ciascuna Transwell inclinando la pipetta contro la parete del vano e rilasciando lentamente il mezzo nel pozzo. Aspirare delicatamente terreno privo di siero da pozzi. A partire da pozzi non infetti o mock-infetto, aggiungere diluizioni virus appropriate al compartimento apicale Transwells. Per i pozzi non infetti, aggiungere 100 microlitri di siero-free EMEM al compartimento apicale di Transwells appropriate, per mock-infettate pozzetti, aggiungere 100 ml di virus diluito in preparazione privo di siero EMEM al compartimento apicale di Transwells caso, e per infezione da virus, diluire virus nel siero senza EMEM e aggiungere 100 microlitri ai compartimenti apicali delle Transwells appropriati. Aggiungere 600 ml di siero-free EMEM in tutti i comparti basolaterali. Incubare a 37 ° C e il 7% CO 2 per 2 h. Aspirare il terreno da pozzi, in primo luogo da pozzi non infetti e mock-infetto, quindi dai pozzi infetti. Rimuovere surnatanti apicali prima, seguita da surnatanti basolaterali. Sostituire medio con 200 pl di EMEM-10% in compartimenti apicali e 600 pl di EMEM-10% in compartimenti basolaterali.