마우스의 림프 Vasculature의 비 침습적 광학 이미징
Summary
가까운 적외선 형광 (NIRF)를 사용하여 최근 개발 된 이미징 기술은 림프 시스템의 암 전이에서 활약 역할, 면역 반응, 상처 수리 및 기타 림프 – 관련 질병을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Abstract
림프 혈관 시스템은 유체 항상성을 유지 배에 면역 감시 및 mediates 지방 흡수를 제공하는 순환 시스템의 중요한 구성 요소입니다. 그러나 그 중요한 기능에도 불구하고 림프 체계는 건강과 질병 1이 기능을 제공하기 위해 적응하는 방법에 비교적 작은 이해가 있습니다. 최근, 우리는 세대 III는 -, 동적 이미지 림프 건축과 림프 등의 추적에 가까운 적외선 형광 (NIRF) 염료의 관리 및 사용자 정의를 사용하여 림프 장애를 앓고 명에서뿐만 아니라 정상적인 인간의 과목에서 '펌핑'작업 할 수있는 기능을 증명 한 이미징 시스템 2-4 강화. NIRF 영상은 인간의 질병과 림프 아키텍처 및 기능에 극적인 변화를 보여 주었다. 그것은 이러한 변경 사항이 발생하여 새로운 동물 모델의 유전자와 분자 기초를 명료하게하다하기 위해 개발되는지는 확실치 남아 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 NIRF의 림프, S를 제공쇼핑몰 동물 영상 5,6 녹색 (ICG), 인간 7 50 년 동안 사용 된 염료, 그리고 우선적으로 마우스와 인간의 알부민 8 바인딩 NIRF 염료 표시 순환 알부민 결합 도메인 (cABD-IRDye800) 펩타이드를 indocyanine 사용 . ICG보다 약 5.5 배 더 밝아, cABD – IRDye800은 비슷한 림프 통관 프로필을 보유하고 있으며 영상 8 충분한 NIRF 신호를 달성하기 위해 ICG보다 작은 회에 걸쳐 주입 할 수 있습니다. 중간 공간 8 알부민에 모두 cABD – IRDye800과 ICG 구속, 그들은 모두에 그리고 lymphatics에서 활성 단백질 수송을 묘사 할 수 있습니다 때문입니다. Intradermal (ID) ICG의 주사 (5-50 μl의) (645 μM) 또는 생리에 cABD-IRDye800 (200 μM)는 각 뒷다리 앞발로 땅을 차다 및 / 또는의 기초의 왼쪽과 오른쪽의 등 부분에 관리되는 isoflurane – anesthetized 마우스의 꼬리. 동물의 결과 염료 농도는 83-1,250 μg / ICG에 대한 kg 또는 113-1,700 μg / kg을위한 것입니다cABD – IRDye800. 즉시 주사 후, 기능 림프 이미징은 사용자 정의, 작은 동물 NIRF 이미징 시스템을 사용하여 최대 1 시간에 진행됩니다. 전체 동물 공간적 해상도는 깊이 3cm 9 취득 할 수에 구조의 형광 림프 100 마이크론 이하의 선박, 이미지를 묘사 할 수 있습니다. 이미지는 V + + 소프트웨어를 사용하여 인수 ImageJ 또는 MATLAB 소프트웨어를 사용하여 분석하고 있습니다. 분석하는 동안, 전체 선박 직경을 포함한 관심 (ROIs)의 연속 영역은 주어진 림프 혈관을 따라 그려 있습니다. 각 투자 수익 (ROI)에 대한 크기가 양적 림프가 혈관을 통해 이동의 "패킷"을 평가하기 위해 각 투자 수익 (ROI)에 대한 측정 주어진 선박 및 NIRF 강도에 대한 지속적인 유지하고있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 쥐이라는 림프 혈관의 이미지를 캡처하는 사용자 정의, 작은 동물 NIRF 이미징 시스템을 사용합니다. 림프 운동의 영화를 구성하는 300 개 이상의 이미지를 수집하고 있습니다. 영화에서 lymphatics의 기능 분석을 위해, 두 개 이상의 ROIs를 수동 림프 혈관을 따라 그려 있습니다. ROIs의 크기는 각 선박에 대한 지속적인 유지와 약 혈관의 직경 있습니다. 전체 동물 공간적 해상도가 100 마이크론 이…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 CA128919 및 NIH R01 HL092923 :이 작품은 에바 Sevick에 다음 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
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