Summary

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

Published: March 08, 2013
doi:

Summary

Kürzlich entwickelte Bildgebungsverfahren mittels Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) kann helfen erläutern die Rolle spielt das Lymphsystem in Krebsmetastasen, Immunantwort, Wundheilung und anderen lymphatischen-assoziierten Krankheiten.

Abstract

Das lymphatische Gefäßsystem ist ein wichtiger Bestandteil des Kreislaufsystems, die Flüssigkeitshomöostase unterhält, bietet Immunüberwachung und vermittelt Fettaufnahme im Darm. Doch trotz seiner kritischen Funktion gibt es vergleichsweise wenig Verständnis dafür, wie das lymphatische System passt sich diese Funktionen in Gesundheit und Krankheit 1 dienen. Vor kurzem haben wir die Möglichkeit, dynamisch image lymphatischen Architektur und Lymphe "Pumpen"-Aktion in normalen menschlichen Probanden sowie Personen, die unter lymphatischen Funktionsstörungen mit trace Verabreichung einer Nah-Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) Farbstoff und eine benutzerdefinierte gezeigt, Gen III- intensiviert Bildgebungssystem 2-4. NIRF Bildgebung zeigten dramatische Veränderungen in den lymphatischen Architektur und Funktion mit menschlichen Krankheiten. Es bleibt unklar, wie sich diese Veränderungen auftreten und neue Tiermodelle entwickelt, um ihre genetischen und molekularen Grundlagen aufzuklären. In diesem Protokoll präsentieren wir NIRF Lymph-, sMall tierischen Bildgebung mit 5,6 Indocyaningrün (ICG), ein Farbstoff, der für 50 Jahre bei Menschen 7 verwendet wurde, und eine NIRF Farbstoffmarkiertes cyclischen Albumin-Bindungsdomäne (CABD-IRDye800) Peptid, vorzugsweise an Maus und Human-Albumin 8 . Etwa 5,5 mal heller als ICG hat Abd-IRDye800 eine ähnliche lymphatischen Lichtraumprofil und kann in kleineren Dosen als ICG ausreichende NIRF Signale für bildgebende 8 zu erreichen injiziert werden. Da sowohl Abd-IRDye800 und ICG binden an Albumin im interstitiellen Raum 8, können sie sowohl aktive Protein-Transport in die und innerhalb der Lymphgefäße darstellen. Intradermale (ID) Injektionen (5-50 ul) von ICG (645 pM) oder CABD-IRDye800 (200 pM) in Kochsalzlösung werden dorsal jedes Hinterpfote und / oder der linken und rechten Seite der Basis des verabreichten Schwanz eines Isofluran-Narkose Maus. Die resultierende Farbstoffkonzentration im Tier ist 83-1,250 ug / kg für ICG oder 113-1,700 ug / kg für'Abd-IRDye800. Unmittelbar nach Injektionen, wird die funktionale lymphatischen Bildgebung für bis zu 1 Stunde mit Hilfe einer angepassten, kleines Tier NIRF Imaging-System durchgeführt. Ganztier räumliche Auflösung darstellen kann fluoreszierenden Lymphgefäßen von 100 Mikron oder weniger, und Bilder von Strukturen bis zu 3 cm tief erworben 9 werden. Die Bilder werden aufgenommen mit V + +-Software analysiert und mit ImageJ oder MATLAB-Software. Während der Analyse werden aufeinander Regions of Interest (ROI), die die gesamte Gefäßdurchmesser entlang einer vorgegebenen Lymphgefäß gezogen. Die Abmessungen für jeden ROI konstant gehalten werden für ein bestimmtes Schiff und NIRF Intensität für jeden ROI gemessene die quantitative Erfassung "Pakete" von Lymphe Bewegen durch Gefäße.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Standards der University of Texas Health Science Center (Houston, TX), Abteilung für Vergleichende Medizin und Zentrum für Molekulare Bildgebung nach Prüfung und Genehmigung des Protokolls durch ihre jeweiligen Institutional Animal Care durchgeführt und Verwenden Ausschuss (IACUC) oder Animal Welfare Committee (AWC). Ein. Vorbereitung der Tiere 24 Stunden vor dem Imaging Die folgenden Schritte müssen get…

Representative Results

Beispiel für NIRF Lymphatische Imaging in Mäuse Wenn ICG-oder CABD IRDye800 ID wird an der Basis des Schwanzes einer normalen Maus injiziert, sollte das lymphatische Gefäßsystem zwischen der Injektionsstelle an der Basis des Schwanzes und des inguinale Lymphknoten (LN) unmittelbar visualisiert. Kurz nach der Injektion (ein paar Sekunden bis Minuten), sollte die Lymphgefäße zwischen der Leistengegend LN und der axillären LN visualisiert werden, wie in Abbildung 2 zu sehen…

Discussion

Wir verwenden eine benutzerdefinierte, kleines Tier NIRF Imaging-System, um Bilder von markierten Lymphgefäße in Mäusen zu erfassen. Um Filme von Lymphe Bewegung konstruieren, sind 300 oder mehr Bilder gesammelt. Zur funktionellen Analyse der Lymphbahnen aus Filmen, werden zwei oder mehr ROIs manuell entlang einer Lymphgefäß gezogen. Die Abmessungen des ROIs konstant gehalten werden für jedes Schiff sind und etwa den Durchmesser des Gefäßes. Während ganze Tier räumliche Auflösung fluoreszierende Lymphgefäße…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH R01 CA128919 und NIH R01 HL092923: Diese Arbeit wurde durch die folgenden Stipendien an Eva Sevick unterstützt.

Materials

Solutions, Reagents, and Equipment Company Catalog Number Comments
Indocyanine green (ICG) Patheon Italia S.P.A. NDC 25431-424-02 Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL)
Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) Bachem Custom Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations
Sterile Water Hospira, Inc., Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
NAIR Church & Dwight Co., Inc. Local Stores www.nairlikeneverbefore.com
Imaging System (components below) Center for Molecular Imaging N/A Custom-built in our laboratories.
Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera Princeton Instruments, Trenton, NJ Photon Max 512
Nikon camera lens Nikon Inc., Melville, NY Model No. 1992, Nikkor 28mm
Optical filter Andover Corp., Salem,NH ANDV11333 Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens
785-nm laser diode Intense Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 500 mW of optical output
Collimating optics Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Collimates laser output prior to cleanup filter
Clean-up filter Semrock, Inc., Rochester, NY LD01-785/10-25 Removes laser emission in fluorescence band
Optical diffuser Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Diffuses the laser over the animal
V++ Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand Version 5.0 Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/
Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis
ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD Most current version available Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Version 2008a or later http://www.mathworks.com/

Referencias

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Robinson, H. A., Kwon, S., Hall, M. A., Rasmussen, J. C., Aldrich, M. B., Sevick-Muraca, E. M. Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse. J. Vis. Exp. (73), e4326, doi:10.3791/4326 (2013).

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