Summary

Um<em> In Vitro</em> Preparação para divulgação e gravação de programas de alimentação do motor com movimentos fisiológicos em<em> Aplysia californica</em

Published: December 05, 2012
doi:

Summary

Nós descrevemos uma técnica para gravar extracelularmente e estimular a partir de nervos, músculos e neurônios individuais identificados<em> In vitro</em> Enquanto eliciar e observar diversos tipos de comportamentos de alimentação no aparelho de alimentação de<em> Aplysia</em>.

Abstract

Multifuncionalidade, a capacidade de uma estrutura periférica de gerar múltiplos comportamentos distintos 1, permite animais para se adaptar rapidamente seus comportamentos a ambientes em mudança. O molusco marinho Aplysia californica fornece um sistema tratável para o estudo da multifuncionalidade. Durante a alimentação, Aplysia gera vários tipos distintos de comportamento utilizando o mesmo aparelho de alimentação, a massa bucal. Os gânglios que controlam esses comportamentos conter um número de grandes neurônios identificados que são acessíveis para estudo eletrofisiológico. A actividade destes neurónios tem sido descrita em programas motores que podem ser divididos em dois tipos, os programas e ingestivo egestive, com base no tempo de actividade neural que fecha o parente grasper alimento para a actividade neural que prolonga-se ou retrai a grasper 2. Contudo, nos gânglios isolado, os movimentos musculares que produzem esses comportamentos são ausentes, tornando-mais difícil de ser determinado se os programas motores observados são correlatos de comportamentos reais. Em gravações nervosas in vivo, e os músculos foram obtidos correspondente a programas de alimentação 2,3,4, mas é muito difícil de gravar directamente a partir de neurónios individuais 5. Além disso, de vivo, programas ingestivo pode ainda ser dividido em mordidas e 1,2 engole, uma distinção que é difícil de fazer na maioria descrito anteriormente em preparações in vitro.

A preparação de massa suspensa bucal (Figura 1) faz a ponte entre núcleos isolados e animais intactos. Nesta preparação, comportamentos ingestivo – incluindo tanto a morder e engolir – e comportamentos egestive (rejeição) pode ser provocada, ao mesmo tempo, como neurónios individuais podem ser registados a partir de e estimulada utilizando eléctrodos extracelulares 6. Os movimentos de alimentação associados com estes comportamentos diferentes podem ser recorded, quantificado e relacionado diretamente para os programas motores. Os programas de motor na preparação de massa suspensa bucal parecem ser mais semelhantes aos observados in vivo do que os programas motores em gânglios provocou isolado. Assim, os programas de motor desta preparação pode estar mais directamente relacionada com comportamento de vivo e, ao mesmo tempo, os neurónios individuais são mais acessíveis para a gravação e a estimulação do que nos animais intactos. Além disso, como um passo intermediário entre gânglios isolado e animais intactos, os achados da massa suspensa bucal pode auxiliar na interpretação de dados obtidos em ambas as configurações mais reduzidas e mais intacta. A preparação da massa suspensa bucal é uma ferramenta útil para caracterizar o controle neural da multifuncionalidade na Aplysia.

Protocol

1. Preparação de Soluções Para preparar as soluções de cloreto de magnésio, que é isotónica com a água do mar em que os animais são mantidos (~ 1.000 millosmolar), marcar um jarro grande no nível de volume desejado. Encher o jarro com água destilada até cerca de 80% deste nível, e pesar a quantidade apropriada de cloreto de magnésio hexa-hidratado para criar uma solução de 333 mM no volume final. Adicionar o cloreto de magnésio para o jarro, fechar a tampa e agitar vigorosamente até que o …

Representative Results

When an extracellular electrode is positioned above a neuron’s soma and used to stimulate the neuron, a one-for-one correspondence between spikes on the soma channel and on the nerve(s) the neuron projects to can be observed (Figure 6, left panel, stimulation of identified neuron B9). The soma channel (top channel) is set to stimulating mode when the current is applied (time 1 in the figure), and is then quickly switched to recording mode (time 2). By maintaining the position of the electrode, the…

Discussion

O trabalho anterior tem caracterizado programas Aplysia a motor em animais intactos e em preparações reduzidas, tais como gânglio isolado. No animal intacto, embora as gravações de neurónios individuais foram obtidos 5, tais experiências são muito difíceis, e os eléctrodos não podem ser movidos entre os neurônios durante a alimentação. Em gânglios isolado, os movimentos de alimentação induzidos pela actividade neural não pode ser observado. A preparação da massa suspensa bucal faz…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH concessão NS047073 e concessão do NSF DMS1010434.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Fisher Scientific S671 Biological, Certified
Potassium chloride Fisher Scientific P217 Certified ACS
Magnesium chloride hexahydrate Acros Organics 19753 99%
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63 Certified ACS
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientifc C79 Certified ACS
Glucose (dextrose) Sigma-Aldrich G7528 BioXtra
MOPS buffer Acros Organics 17263 99%
Carbachol Acros Organics 10824 99%
Sodium hydroxide Fisher Scientific SS255 Certified
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA49 Certified
Single-barreled capillary glass A-M Systems 6150  
Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC Sutter Instruments   Filament used: FT345B
Enamel coated stainless steel wire California Fine Wire   0.001D, coating h
Household Silicone II Glue GE    
Duro Quick-Gel superglue Henkel corp.    
A-M Systems model 1700 amplifier A-M Systems   Filter settings: 300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle
Pulsemaster Multi-Channel Stimulator World Precision Instruments A300  
Stimulus Isolator World Precision Instruments A360  
AxoGraph X AxoGraph Scientific    
Veeder-Root Totalizing Counter Danaher C342-0562  
Gold Connector Pins Bulgin SA3148/1  
Gold Connector Sockets Bulgin SA3149/1  
Sylgard 184 Silicone Elastomer Dow Corning    
100 x 50 mm Crystalizing Dish Pyrex    
High Vacuum Grease Dow Corning    
Pipet Tips Fisher Scientific 21-375D  
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-10  
Modeling Clay Sargent Art 22-4400  
Silk Sutures Ethicon K89OH  
Whisper Air Pump Tetra 77849  
Aquarium Tubing Eheim 7783 12/16 mm
Elite Airstone Hagen A962  
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08  
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20  
Yaki Sushi Nori Seaweed Rhee Bros    
Kimwipes Kimberly-Clark 34155  

Referencias

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McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320, doi:10.3791/4320 (2012).

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