Summary

Immunohistologische Etikettering van microtubuli in Sensory Neuron Dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de Drosophila Larve Body Muur

Published: November 10, 2011
doi:

Summary

Om te begrijpen hoe complex cel vormen, zoals neuronale dendrieten, worden bereikt tijdens de ontwikkeling, is het belangrijk om nauwkeurig te kunnen assay microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode om microtubule organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten, de luchtpijp, spier-onderzoeken en andere<em> Drosophila</em> Larve lichaamswand weefsels.

Abstract

Om te begrijpen hoe verschillen in complexe cellen vormen zijn bereikt, is het belangrijk om nauwkeurig te volgen microtubuli organisatie. De Drosophila larven lichaam muur bevat verschillende celtypen die zijn modellen om cellen en weefsels morfogenese bestuderen. Bijvoorbeeld luchtpijp worden gebruikt om de buis morfogenese 1, en ​​de dendritische arborization (DA) sensorische neuronen van de Drosophila larven hebben een primaire systeem worden voor de opheldering van algemene en neuron-class-specifieke mechanismen van dendritische differentiatie 2-5 en degeneratie zes onderzoeken .

De vorm van dendriet takken kunnen sterk variëren tussen neuron klassen, en zelfs tussen verschillende takken van een enkel neuron 7,8. Genetische studies in DA neuronen suggereren dat differentieel organisatie van het cytoskelet kan morfologische verschillen in dendritische branche vorm 4,9-11 ten grondslag liggen. Wij bieden een robuuste immunologische etikettering methode om eenssay in vivo microtubuli organisatie in DA sensorische neuron dendriet prieel (figuren 1, 2, Film 1). Dit protocol geeft de dissectie en immunokleuring van de eerste instar larve, een stadium waarin actieve sensorische neuron dendriet uitgroei en vertakking organisatie is 12,13 optreedt.

In aanvulling op vlekken sensorische neuronen, deze methode bereikt robuuste kenmerken van microtubuli organisatie in de spieren (Movies 2, 3), luchtpijp (Figuur 3, Movie 3), en andere lichaamsdelen muur weefsels. Het is waardevol voor onderzoekers die willen microtubuli organisatie te analyseren in situ in het lichaam muur bij het ​​onderzoek naar de mechanismen die de controle weefsels en cellen vorm.

Protocol

1. Bereiding van reagentia Opmerkingen voor het begin van: Dissection en immunohistochemische kleuring worden uitgevoerd in een magnetische kamer en de larve wordt vastgepind met behulp van speciaal gevormde insect pinnen. Gedetailleerde instructies voor de bouw van een magnetische kamer, en voorbereiding van deze pinnen is te vinden in gerelateerde referenties 14,15. In het kort, is een 1x1cm vierkant gat gesneden in een magnetische plaat en een dekglaasje aangebra…

Discussion

Om te begrijpen hoe complex cel vormen zijn bereikt, is het belangrijk om te kunnen nauwkeurig test microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode voor het testen van microtubuli organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten. In aanvulling op vlekken sensorische neuronen, deze methode bereikt robuuste immunohistologische kleuring van luchtpijp, spieren en andere lichaamsdelen muur weefsels.

Wij gebruiken dit pr…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken RIKEN voor financiering. P10-Gal4 was een soort geschenk van Alain Vincent (Universite Paul Sabatier, Toulouse, Frankrijk).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue
number
Comments
(optional)
Forceps Dumont 11251-20  
Microscissors FST 15000-08  
Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) Sigma T9026 Dilution 1/1000
Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10),
supernatant
Developmental
Studies
Hybridoma Bank
22C10 Dilution 1/1000
Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) Caltag MCD0800 Dilution 1/1000
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG Invitrogen A-11001 Dilution 1/500
Cy3 anti-Rat IgG Jackson Immunoresearch 712-166-150 Dilution 1/200

Referencias

  1. Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
  2. Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
  3. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
  4. Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
  5. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
  6. Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington’s Disease-Like Model. J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
  7. Ramon y Cajal, S. . Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation. , (1911).
  8. London, M., Hausser, M. Dendritic computation. Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  9. Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
  10. Li, W., Gao, F. B. Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields. J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).
  11. Ye, B. Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1. J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).
  12. Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63, 788-802 (2009).
  13. Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
  14. Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions. Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).
  15. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
  16. Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).
  17. Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles. PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).
  18. Dubois, L. Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity. Development. 134, 4347-4355 (2007).
  19. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
  20. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26, 357-370 (2000).
  21. Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36, 15-26 (1984).
  22. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).
  23. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).
  24. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).
  25. Tao, J., Rolls, M. M. Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning. J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).
  26. Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface. Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).
  27. Mattie, F. J. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).
  28. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).
  29. Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).

Play Video

Citar este artículo
Yalgin, C., Karim, M. R., Moore, A. W. Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall. J. Vis. Exp. (57), e3662, doi:10.3791/3662 (2011).

View Video