Summary

Разбор и культуры Чик Statoacoustic ганглия и спинного мозга при эксплантов Коллаген Гели для нейритов Анализы вырост

Published: December 20, 2011
doi:

Summary

Мы показываем, как препарировать и культуре куриных Е4 statoacoustic ганглия и E6 спинного эксплантов мозга. Эксплантов культивируют в бессывороточной условия в 3D гели коллагена в течение 24 часов. Нейритов отзывчивость тестируется с фактором роста дополнена средой и с белком покрытием бисером.

Abstract

Органов чувств куриного внутреннего уха иннервируются периферических процессов statoacoustic ганглий (SAG) нейронов. Сенсорная иннервация органа зависит от сочетания аксон руководством сигналы 1 и 2 факторов выживания, расположенных вдоль траектории растущих аксонов и / или в рамках своей цели сенсорных органов. Например, функциональные вмешательство в классический аксон руководством сигнального пути, semaphorin-neuropilin, генерируемых misrouting из ушной аксонов 3. Кроме того, некоторые факторы роста, выраженный в сенсорных целей внутреннего уха, в том числе нейротрофина-3 (NT-3) и производные мозга нейротрофический фактор (BDNF), были изменены в трансгенных животных, опять же ведет к misrouting СА аксонов 4. Эти же молекулы способствующие выживанию и аксонов нейронов куриных SAG в пробирке 5,6.

Здесь мы описываем и продемонстрировать в пробирке методом мы в настоящее время упеть проверить отзывчивость нейритов куриных SAG в растворимые белки, в том числе известные морфогенов таких как Wnts, а также факторы роста, которые имеют важное значение для содействия SAG результатом аксонов и нейронов выживания. Используя эту модель системы, мы надеемся сделать выводы об эффектах, которые выделяются лигандов может оказывать на SAG выживанию нейронов и аксонов.

SAG эксплантов расчленены на 4-й день эмбрионального (Е4) и культивировали в трехмерном гели коллагена под бессывороточной условиях в течение 24 часов. Во-первых, нейритов отзывчивость проверяется при культивировании эксплантов с белком-добавляемой среде. Затем, чтобы спросить, есть ли точечных источников выделяется лиганды могут иметь направленного воздействия на аксонов, эксплантаты являются со-культивировали с белком покрытые бисером и анализировали на способность борта к локально способствовать или препятствовать нарост. Мы также включаем демонстрации вскрытия (модифицированный протокол 7) и культуры E6 спинного эксплантов мозга. Мыобычно используют спинного эксплантов шнур для подтверждения биологической активности белков и белковых пропитанной бисера, а также для проверки видов перекрестной реактивности с куриных ткани, в тех же условиях культуры как SAG эксплантов. Эти тесты в пробирке удобны для быстрого скрининга молекул, которые оказывают трофические (выживание) или тропического (по направлению) воздействие на нейроны SAG, особенно перед проведением исследования в естественных условиях. Более того, этот метод позволяет испытания отдельных молекул под бессывороточной условиях, с высокой выживаемости нейронов 8.

Protocol

Рецепты Чик Ringers 7,2 г NaCl 0,23 г CaCl 2 + 2H 2 O 0,37 г KCl 0,115 г Na 2 HPO 4 900 мл Вода (степень культуры ткани) Примечание: Регулировка рН до 7,4. Принесите…

Discussion

Мы представляем метод препарировать и культуры E4 и E6 SAG спинного эксплантов мозга, от цыпленка, под бессывороточной условиях. Эта процедура в настоящее время используется в нашей лаборатории для изучения влияния различных выделяется лигандов на SAG выживанию нейронов и аксонов. Новые а?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья Грант RO1DC002756 и Purdue исследовательский фонд. Мы благодарим Дорис Ву Чанг и Визе за советом с экспериментами и Родни McPhail за помощью цифр.

Materials

Reagent Company Catalogue number Comment
Equipment

 

   
Dissection microscope

 

  We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination
Slide warmer

C.S. & E.

  Collagen polymerization
Chicken egg incubator

 

   
37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator

 

   
 

 

   
Dissection Materials

 

   
Sylgard© coated petri dish

 

   
24-well cell culture plate

Corning

3526  
#5 Dumont forceps

Fine Science Tools

11252-30  
#55 Dumont forceps

Fine Science Tools

11295-51  
Stainless steel dissecting pins

Fine Science Tools

26002-10 Embryo pinning, fine dissection
Moria perforated spoon

Fine Science Tools

10370-17 Embryo harvest/transfer
200 µl wide mouth pipet tips

Dot Scientific Inc

118-96R Explant transfer
 

 

   
E4 and E6 chicken eggs

 

   
Chick Ringer’s solution

 

  Embryo harvest
HBSS

Sigma

H8264 SAG dissection
L15 medium

Sigma

L5520 Spinal cord dissection medium
Fetal calf serum

Atlanta Biologicals

S11150 Spinal cord dissection medium
Vannas Scissors

World Precision Instruments

501778 Spinal cord dissection
 

 

   
Collagen preparation

 

   
Rat-tail collagen Type I

BD Biosciences

354249 Explant culture
10X PBS (Sterile)

 

  To neutralize collagen
1N NaOH (Sterile)

 

  To neutralize collagen
Distilled water (Sterile)

 

  To neutralize collagen
pH indicator papers (6.0-8.1)

Whatman

2629-990 To check collagen pH
15 ml conical tubes

Dot Scientific Inc

818-PG  
500 µl wide mouth pipet tips

Dot Scientific Inc

119-R100 To pipet collagen
 

 

   
Explant culture

 

   
DMEM/F12 medium

Sigma

D8437 Explant culture medium
ITS+1

Sigma

I2521 Medium supplement
Penicillin-Streptomycin

Invitrogen

15140-122 Medium supplement
CNTF (rat)

Sigma

C3835 Medium supplement
NT-3 (human)

Sigma

N1905 Medium supplement
Purified mouse Wnt5a

R&D Systems

645-WN-010  
Affi-gel Blue gel beads

Bio-Rad

153-7302  
 

 

   
Immunohistochemistry

 

   
Paraformaldehyde

Sigma

P6148 Fixation
PBS

 

  Rinses
Triton X-100

Sigma

T9284 Blocking solution
Sodium azide

Sigma

S8032 Blocking solution
Calf serum

Invitrogen

16170-078 Blocking solution
Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody

Sigma

T8535 Labels cell bodies and neurites
Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody

Invitrogen

A21141 Detects β Tubulin antibody
Teflon micro spatula

VWR

57949-033 Release collagen gels from well

Referencias

  1. Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
  2. Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
  3. Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
  4. Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
  5. Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
  6. Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
  7. Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
  8. Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
  9. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
  10. Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
  11. Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
  12. Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
  13. Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).

Play Video

Citar este artículo
Fantetti, K. N., Fekete, D. M. Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays. J. Vis. Exp. (58), e3600, doi:10.3791/3600 (2011).

View Video