La disección del ganglio y Cultura polluelo Statoacoustic y explantes médula espinal en geles de colágeno para ensayos neurite

Los órganos sensoriales del oído interno de pollo son inervados por los procesos periféricos del ganglio statoacoustic (SAG), las neuronas. Inervación sensorial del órgano depende de una combinación de señales de orientación axón ¹ y ² factores de supervivencia situadas a lo largo de la trayectoria de los axones en crecimiento y / o dentro de sus objetivos órgano sensorial. Por ejemplo, la interferencia funcional con una vía axón orientación clásica de señalización, semaforina-neuropilina, genera misrouting de los axones ótica ^3. Además, varios factores de crecimiento expresados ​​en los objetivos sensoriales del oído interno, incluyendo la neurotrofina-3 (NT-3) y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), han sido manipulados en animales transgénicos, lo cual también misrouting de ⁴ axones SAG. Estas mismas moléculas promueven la supervivencia y crecimiento de las neuritas de neuronas SAG pollo in vitro ^5,6.

En este sentido, describir y demostrar el método in vitro que actualmente ucantar para poner a prueba la capacidad de respuesta de neuritas SAG de pollo a las proteínas solubles, como morfógenos conocido como el Wnts, así como los factores de crecimiento que son importantes para promover la extensión de neuritas SAG y la supervivencia de las neuronas. El uso de este sistema de modelo, que esperamos para sacar conclusiones sobre los efectos que los ligandos secretados pueden ejercer sobre la supervivencia de las neuronas SAG y crecimiento de las neuritas.

Explantes SAG se diseccionan en el día embrionario 4 (E4) y cultivadas en geles de colágeno tridimensional bajo condiciones libres de suero durante 24 horas. En primer lugar, la capacidad de respuesta de neuritas es probado por el cultivo de explantes con la proteína-medio suplementado. Luego, para preguntar si las fuentes puntuales de ligandos secretados pueden tener efectos direccionales en neurite, los explantes son co-cultivadas con granos recubiertos de proteínas y ensayados para la capacidad de la cuenta para promover a nivel local o inhibir la extensión. También se incluye una demostración de la disección (protocolo modificado ⁷⁾ y la cultura de E6 explantes de la médula espinal. Nosotrosutilizan de forma habitual explantes la médula espinal para confirmar la bioactividad de las proteínas y los granos remojados en proteínas, y para verificar las especies de reactividad cruzada con los tejidos de pollo, bajo la mismas condiciones de cultivo como explantes SAG. Estos ensayos de vitro son convenientes para la rápida detección de las moléculas que ejercen trófica (supervivencia) o el trópico (direccional) efectos sobre las neuronas de la SAG, especialmente antes de la realización de estudios in vivo. Además, este método permite el ensayo de las moléculas individuales en condiciones libres de suero, con una alta supervivencia de las neuronas ^8.