Ein Standard-Ansatz zur Erwachsenen vorbereiten<em> Drosophila</em> Augen für semi-dünne Schnitte und leichte mikroskopische Analyse wird hier vorgestellt. Das Protokoll kann bei grober morphologische Analyse von Fehlsichtigkeiten eingesetzt werden, oder mit den angegebenen Einstellungen können verwendet werden, um genetische Voraussetzungen von Genen in bestimmten Zelltypen des Auges (zB klonale Analyse von Photorezeptoren) oder für elektronenmikroskopische Analyse zu bestimmen.
Drosophila ist seit langem als Modellsystem verwendet worden, um Entwicklung zu studieren, vor allem wegen der Leichtigkeit, mit der sie genetisch manipulierbaren. Im Laufe der Jahre haben eine Fülle von Mutanten und technischen Tricks wurden entwickelt, damit anspruchsvolle Fragen gestellt und beantwortet werden in einer angemessenen Höhe der Zeit. Fundamental Einblick in das Zusammenspiel von Bauteilen aller bekannten großen Signalwege hat in uns gewonnen und genetische Studien Drosophila. Die Fliege Auge hat sich außerordentlich gut für die Mutationsanalyse geeignet sein, da unter Laborbedingungen, fliegt ohne funktionelle Augen überleben können. Darüber hinaus ist die Oberfläche des Insekts Auge von rund 800 individuelle Einheit Augen (Facetten-oder Facettenaugen), dass eine regelmäßige, glatte Oberfläche bilden, wenn bei unter einem Binokular betrachtet komponiert. So ist es leicht zu sehen, ob eine Mutation könnte der Entwicklung des Auges oder das Wachstum von extern auf der Suche nach dem Verlust der glatten Oberfläche ('rough Auge "Phänotyp; Abb. 1). Beeinträchtigen oder insgesamt Auge Größe, bzw. (für Beispiele von Bildschirmen auf der Grundlage externe Auge Morphologie siehe zB 1). Nachfolgende detaillierte Analysen Auge Phänotypen benötigen Fixierung, Kunststoff eingebettet und Dünnschicht-Schnitte von erwachsenen Augen.
Die Drosophila Auge entwickelt sich aus der so genannten Eye-Imaginalscheibe, eine Tüte mit Epithelzellen, und vermehren sich differenzieren in Larven-und Puppenstadium Stufen (für eine Übersicht siehe zB 2). Jedes Ommatidium besteht aus 20 Zellen, darunter acht Photorezeptoren (PR-oder R-Zellen;. Abb. 2), vier Objektiv-sezernierenden Zapfen, Pigmentzellen ("Sechseck" um R-Zell-Cluster) und eine Borste. R8 [Abb.; Die Photorezeptoren jedes Ommatidium, am leichtesten durch ihre lichtempfindlichen Organellen, die Rhabdomere sind in einem Trapez aus den sechs "äußeren" (R1-6) und zwei "inneren" Photorezeptoren (R7 / 8 aus organisiert identifiziert . 2] ist unter R7 und damit nur in den Abschnitten aus den tieferen Bereichen des Auges zu sehen). Das Trapez jeder Facette ist genau mit denen der Nachbarn und der gesamten ap und dorsoventral Achsen des Auges (Abb. 3A) ausgerichtet. Insbesondere die Facettenaugen der dorsalen und ventralen (schwarz und rote Pfeile jeweils) Hälften des Auges sind Spiegelbilder voneinander und entsprechen den beiden chiralen Formen während planaren Zellpolarität Signalisierung (für eine Übersicht siehe z. B. 3) etabliert.
Die Methode, die semi-dünne Auge Abschnitte erzeugen (wie in Abb.. 3 dargestellt) hier beschriebene geringfügig von der ursprünglich von Tomlinson und Ready 4 beschrieben modifiziert. Es ermöglicht die morphologische Analyse aller Zellen mit Ausnahme der transparenten Kegel-Zellen. Darüber hinaus kann das Pigment der R-Zellen (blau Pfeilspitzen in Abb.. 2 und 3) als Zell-autonome Marker für den Genotyp eines R-Zelle, also genetische Voraussetzungen von Genen in einer Untergruppe von R-Zellen verwendet werden können leicht bestimmt werden 5,6.
Mit Drosophila als Modellorganismus, genetische Screens führten zur Identifizierung von vielen zu den Gründungsmitgliedern von Genfamilien essentiell für die meisten der hoch konservierten Signalwegen in höheren Eukaryonten einschließlich des Menschen. Da unter Laborbedingungen, ist eine funktionelle Auge entbehrlich für das Überleben, ist das Auge besonders gut geeignet Gewebe für die Entdeckung neuer Genfunktionen und die Bewertung der genetischen Netzwerken. Ultrastrukturelle Analyse der Fliege Auge mit dem beschriebenen Verfahren führte somit zu grundlegenden Entdeckungen relevant für die Entwicklung und Krankheit. Ursprünglich war einzigen Zelle klonale Analyse unter Verwendung von X-ray induzierten Klone mit bekannten eng verbundenen Zell-autonome rezessiven Marker kombiniert. In jüngerer Zeit hat die Verfügbarkeit des FLP / FRT-System, um Klone zu erzeugen, erheblich die phänotypische Analyse der letalen Mutationen in Auge Abschnitte 6,9 erleichtert.
Die Analyse der Augen-Abschnitten ist nicht zu Tangentialschnitt hier beschriebenen beschränkt. Falls gewünscht, können die Köpfe in beliebiger Orientierung in den Formen ausgerichtet werden und Querschnitte erhalten, um tiefere Schichten in den Kopf, wie die Lamina und Medulla zu studieren. Die hier beschriebene Protokoll ist somit eine vielseitige Methode zur Analyse von Auge und Kopf Strukturen Drosophila Erwachsene.
The authors have nothing to disclose.
Ich möchte Dr. Jennifer Curtiss für die Bilder in Abb. danken. 1 und Jeremy Fagan und Dr. Florence Marlow für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Unsere Arbeit wird von NIH 1R01GM088202 unterstützt.
General equipment:
Fixation solutions:
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette.
Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.
Staining solution:
1% Toluidine-blue in 1% Borax.
Soft | Hard | |
---|---|---|
Resin A | 54g | 50g |
Hardener B | 44.5g | 50g |
Accelerator C | 2.5g | 1.75g |
Plasticizer D | 10g | 0.75g |
Table 1. Resin preparation
To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
Reagent | Supplier | Catalog number |
---|---|---|
Fly pad | e.g. Genesee | 59-119 |
Glutaraldehyde | Sigma | G7526-10 X 10 ML |
OsO4 | Polysciences,Inc. | 0972A-20 |
Propyleneoxide | Fisher | 04332-1 |
Scalpel handles, for #3 | Fisher | 22080046 |
Scalpel blades #11 | Fisher | 08-916-5B |
Transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M |
Durcupan (R) ACM resin | Sigma (Fluka) | 44610-1EA |
Steel dissecting needle | Fisher | S17346 |
BEEM flat embedding mold | Electron Microscopy Sci. | 70904-12 |
Teflon coated razor blades | Electron Microscopy Sci. | 71970 |
Q-tip (sterile swabs) | Fisher | 14-959-81 |
Glass slides | Fisher | 12-550-143 |
Cover slips No 1, 22X60 mm | Fisher | 12-531K |
Gelatin | Fisher | ICN96010280 |
Cr(III) K SO4 dodecahydrate | Sigma | 243361 |
Diamond Histo knife, 6mm | Diatome US | 60-His |
Toluidine Blue O | Fisher | BP107-10 |
Borax (Na-Tetraborate) | Fisher | AC20629-1000 |
DPX mounting medium | Sigma | 44581-100ML |
Table 2. Materials