إعداد الكبار ذبابة الفاكهة لعيون Sectioning رقيقة والتحليل المجهري
Summary
نهج موحد لإعداد الكبار<em> ذبابة الفاكهة</emويرد> عيون لشبه رقيقة sectioning والتحليل المجهري الضوء هنا. ويمكن استخدام بروتوكول للتحليل الصرفي من العيوب الجسيمة العين ، أو يمكن استخدامها مع التعديلات وأشار إلى تحديد الاحتياجات من الجينات الوراثية في أنواع معينة من الخلايا في العين (تحليل نسيلي مبصرات مثلا) أو لأغراض التحليل المجهري الإلكترون.
Abstract
منذ فترة طويلة ذبابة الفاكهة تستخدم نظام نموذجي لدراسة التنمية ، ويرجع ذلك أساسا إلى السهولة التي كان لين العريكة وراثيا. على مر السنين ، وقد وضعت مجموعة كبيرة من سلالات متحولة والحيل التقنية للسماح أسئلة معقدة والإجابة عليها في كمية معقولة من الزمن. لقد تم الحصول على الرؤية الاساسية في تفاعل مكونات جميع الممرات الرئيسية المعروفة في إشارة إلى الأمام وعكس الدراسات الجينية ذبابة الفاكهة. وقد ثبت للعين أن يطير جيدا بشكل استثنائي مناسبة لتحليل طفرية ، منذ ذلك الحين ، تحت ظروف المختبر ، والذباب يمكن أن يعيش من دون عيون وظيفية. وعلاوة على ذلك ، يتألف سطح العين الحشرات من بعض العيون 800 وحدة الفرد (أو جوانب ommatidia) الذي شكل منتظم ، وسطح أملس عندما نظرت إلى تشريح تحت المجهر. وهكذا ، فإنه من السهل أن نرى ما إذا كان قد تحور تؤثر على التنمية العين أو النمو من خلال النظر خارجيا لفقدان سطح أملس ('العين الخام" النمط الظاهري ؛ الشكل 1) أو الحجم الكلي العين ، على التوالي (للاطلاع على أمثلة من الشاشات على أساس مورفولوجيا العين الخارجية انظر على سبيل المثال 1). تحليلات مفصلة لاحقة من الظواهر تتطلب تثبيت العين ، تضمين البلاستيك ورقيقة sectioning عيون الكبار.
عين ذبابة الفاكهة يطور من القرص العين يسمى تخيلي ، كيس من الخلايا الظهارية التي تتكاثر والتفريق خلال مراحل اليرقات والعذراء (انظر 2 للمراجعة مثلا). كل ommatidium يتكون من 20 زنزانة ، بينهم ثمانية من المستقبلات الضوئية (PR أو R الخلايا ؛ الشكل رقم 2) ، وأربع خلايا مخروطية عدسة إفراز ، الخلايا الصبغية ('السداسي" حول الخلية R – الكتلة) وشعيرات ملف. ومبصرات كل ommatidium ، ومعظم التعرف عليها بسهولة من قبل هذه العضيات الحساسة للضوء ، rhabdomeres ، هي التي نظمت في شبه المنحرف تتكون من "الخارجي" ستة (R1 – 6) واثنين من "الداخلية" المستقبلات الضوئية (R7 / 8 ؛ R8 [التين 2] هو تحت R7 ، وبالتالي ينظر فقط في الفروع من المناطق العميقة من العين). يتم محاذاة بدقة شبه منحرف من كل جانب مع تلك جيرانها والمحاور الشاملة وظهري بطني الأمامي الخلفي من العين (الشكل 3A). على وجه الخصوص ، من ommatidia (الأسهم السوداء والحمراء ، على التوالي) وظهري بطني نصفين من العين هي صور طبق الأصل من بعضها البعض ، وتتوافق مع شكلين مراوان مستو وضعت خلال إشارات الخلية القطبية (انظر على سبيل المثال للمراجعة 3).
وصف طريقة لتوليد أقسام العين شبه رقيقة (مثل تلك التي قدمت في الشكل 3) هنا هو تعديل طفيف من وصفها توملينسون في الأصل من قبل وجاهز 4. فهو يسمح للتحليل الصرفي لجميع الخلايا باستثناء الخلايا المخروطية شفافة. بالإضافة ، يمكن استخدام صبغة R – الخلايا (السهام الزرقاء في الشكل 2 و 3) كعلامة خلية مستقلة عن التركيب الوراثي للخلية – R ، ومتطلبات الوراثية وبالتالي من الجينات في مجموعة فرعية من الخلايا يمكن R بسهولة يمكن تحديد 5،6.
Protocol
Discussion
ذبابة الفاكهة واستخدام نموذج حي ، وشاشات وراثية أدت إلى تحديد العديد من الأعضاء المؤسسين للعائلات الجينات الأساسية لمعظم المسارات المحفوظة للغاية مما يشير الى ارتفاع حقيقيات النواة بما فيها البشر. منذ ذلك الحين ، تحت ظروف المختبر ، والعين هي وظيفية يمكن الاستغناء عنها من أجل البقاء ، والعين هي الأنسجة وخاصة مناسبة تماما لاكتشاف وظائف الجينات رواية وتقييم الشبكات الجينية. تحليل التركيبية للعين الذبابة باستخدام الطريقة الموصوفة وبالتالي أدى إلى اكتشافات الأساسية ذات الصلة من أجل التنمية والمرض. في البداية ، تم إجراء تحليل وحيد الخلية نسيلي باستخدام الأشعة السينية التي يسببها استنساخ جنبا إلى جنب مع علامات الخلية يعرف الحكم الذاتي مرتبطة ارتباطا وثيقا المتنحية. في الآونة الأخيرة ، وقد سهلت توافر نظام FLP / FRT لتوليد الحيوانات المستنسخة كثيرا من التحليل المظهرية للطفرات المميتة في أقسام العيون 6،9.
ولا يقتصر تحليل المقاطع إلى مقاطع عرضية العين الموصوفة هنا. إذا رغبت في ذلك ، يمكن محاذاة الرؤوس في أي اتجاه في قوالب ويمكن الحصول على المقاطع العرضية لدراسة الطبقات الأعمق في رأسه مثل الصفيحة والنخاع. بروتوكول الموصوفة هنا هو بالتالي وسيلة لتحليل تنوعا من البالغين العين ورأس ذبابة الفاكهة الهياكل.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأود أن أشكر الدكتور جنيفر كيرتس للصور في الشكل. (1) وجيريمي والدكتور فلورنسا فاغان مارلو لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم عملنا المعاهد الوطنية للصحة منح 1R01GM088202.
Materials
General equipment:
- For general fly husbandry see 10
- Standard dissection microscope (e.g. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope), preferably with a ring light source to prevent casting a shadow of your hands.
- CO2 Fly pad, covered with 3MM Whatman paper to provide protection against dirt during dissection.
- Gelatin coated slides: dissolve 10g gelatin and 1g CrKSO4x 12 H2O in 1L water on a heating plate (bring almost to a boil, takes approximately 2 hrs). Dip well washed (soap) and rinsed (dH2O) slides in holders into gelatin solution and air-dry covered with foil overnight.
- Heating oven (70°C; old vacuum ovens that were used for nitrocellulose filter drying are well suited for this purpose).
- Microtome capable of ultrathin sectioning (0.5-1 μm thick sections), e.g. those used by electron microscopy facilities. We use a Sorvall MT5000 Ultramicrotome with a Histo quality diamond knife. Glass knives also work.
Fixation solutions:
- Prepare a stock solution of 0.2 M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2.
- Prepare 2% glutaraldehyde in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2 (can be stored at 4°C for 4 weeks). Make at least enough to have 200μl per genotype you want to embed. Keep on ice.
- Osmium solution: 2% OsO4 in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Make only enough to have 200μl per genotype you want to embed, since the solution cannot be stored. Keep on ice.
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette.
Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.
Staining solution:
1% Toluidine-blue in 1% Borax.
| Soft | Hard | |
|---|---|---|
| Resin A | 54g | 50g |
| Hardener B | 44.5g | 50g |
| Accelerator C | 2.5g | 1.75g |
| Plasticizer D | 10g | 0.75g |
Table 1. Resin preparation
To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
| Reagent | Supplier | Catalog number |
|---|---|---|
| Fly pad | e.g. Genesee | 59-119 |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7526-10 X 10 ML |
| OsO4 | Polysciences,Inc. | 0972A-20 |
| Propyleneoxide | Fisher | 04332-1 |
| Scalpel handles, for #3 | Fisher | 22080046 |
| Scalpel blades #11 | Fisher | 08-916-5B |
| Transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M |
| Durcupan (R) ACM resin | Sigma (Fluka) | 44610-1EA |
| Steel dissecting needle | Fisher | S17346 |
| BEEM flat embedding mold | Electron Microscopy Sci. | 70904-12 |
| Teflon coated razor blades | Electron Microscopy Sci. | 71970 |
| Q-tip (sterile swabs) | Fisher | 14-959-81 |
| Glass slides | Fisher | 12-550-143 |
| Cover slips No 1, 22X60 mm | Fisher | 12-531K |
| Gelatin | Fisher | ICN96010280 |
| Cr(III) K SO4 dodecahydrate | Sigma | 243361 |
| Diamond Histo knife, 6mm | Diatome US | 60-His |
| Toluidine Blue O | Fisher | BP107-10 |
| Borax (Na-Tetraborate) | Fisher | AC20629-1000 |
| DPX mounting medium | Sigma | 44581-100ML |
Table 2. Materials
Referencias
- Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114, 457-457 (2003).
- Secombe, J., Li, L., Carlos, L., Eisenman, R. N. The Trithorax group protein Lid is a trimethyl histone H3K4 demethylase required for dMyc-induced cell growth. Genes Dev. 21, 537-537 (2007).
- Cagan, R. Principles of Drosophila eye differentiation. Curr Top Dev Biol. 89, 115-115 (2009).
- Jenny, A. Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye. Curr Top Dev Biol. 93, 189-189 (2010).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Cell fate in the Drosophila Ommatidium. Dev. Biol. 123, 264-264 (1987).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-366 (1987).
- Jenny, A., Darken, R. S., Wilson, P. A., Mlodzik, M. Prickle and Strabismus form a functional complex to generate a correct axis during planar cell polarity signaling. Embo J. 22, 4409-4409 (2003).
- Zheng, L., Zhang, J., Carthew, R. W. frizzled regulates mirror-symmetric pattern formation in the Drosophila eye. Development. 121, 3045-3045 (1995).
- Reinke, R., Zipursky, S. L. Cell-cell interaction in the Drosophila Retina: The bride of sevenless Gene is required in photoreceptor cell R8 for R7 cell development. Cell. 55, 321-321 (1988).
- Wolff, T., Rubin, G. M. strabismus, a novel gene that regulates tissue polarity and cell fate decisions in Drosophila. Development. 125, 1149-1149 (1998).
- Winter, C. G. Drosophila Rho-associated kinase (Drok) links Frizzled-mediated planar cell polarity signaling to the actin cytoskeleton. Cell. 105, 81-81 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1223 (1993).
- Stocker, H., Gallant, P., Dahmann, C. . Methods Mol Biol. 420, 27-27 (2008).
