Entwicklung von kundenspezifischen Assays auf der ViBE Plattform für empfindlichere, reproduzierbare, automatisierte Ergebnisse in komplexen Matrices beschrieben ist. Die Universal-Kassette ermöglicht Assays zu leicht für die Verwendung mit benutzerdefinierten Tests angepasst werden. Diese Vielseitigkeit ermöglicht die schnelle Entwicklung und Validierung neuer Tests oder automatisierte Versionen bestehender manueller Tests, in diesem Video veranschaulicht.
Benutzerdefinierte Assays für einzigartige Proteine werden oft zeitraubende manuelle Erfassung und Quantifizierung Techniken wie ELISA oder Western Blots auf Grund der Komplexität der Entwicklung auf alternative Plattformen beschränkt. BioScale proprietären Acoustic Membrane Mikropartikel (AMMP)-Technologie ermöglicht Sandwich-Immunoassays zu leicht für die Verwendung auf dem ViBE Plattform entwickelt werden, was eine bessere Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und automatisierten Betrieb. Vorausgesetzt, als Beispiel, werden in diesem Protokoll das Verfahren für die Entwicklung eines benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Host Cell Protein (CHO-HCP)-Assay. Die allgemeinen Grundsätze hier skizzierten kann für die Entwicklung einer breiten Palette von Immunoassays verfolgt werden.
Ein AMMP Assay misst Antigen-Konzentration durch die Messung von Veränderungen in Schwingfrequenz durch die Bindung von Mikropartikeln verursacht, die Sensorfläche zu berechnen. Es besteht aus vier Hauptkomponenten: (1) eine Patrone, die eine funktionalisierte acht Sensor-Chip enthält (2) Antikörper markiert magnetische Mikropartikel, (3) Hapten markierten Antikörper an die Oberfläche der funktionalisierten Chip (4) Proben, die das Antigen bindet Interesse. BioScale der Biosensor ist ein Resonanz-Gerät, das acht einzelnen Membranen mit separatem fluidische Pfade enthält. Die Membranen ändern Schwingungsfrequenz in Reaktion auf Masse ansammeln auf der Oberfläche und diese Frequenz ändern wird verwendet, um die Menge des zugegebenen Masse zu quantifizieren.
Für die Verwendung in einer Vielzahl von Immunoassays der Sensor mit einem Anti-Hapten-Antikörper funktionalisierten erleichtern. Assay spezifische Antikörper werden durch die kovalente Konjugation von Hapten-Tag, um einen Antikörper und Biotin auf die andere geändert. Die Biotin-Markierung verwendet wird, um den Antikörper binden an gekoppelten magnetischen Beads, die in Kombination mit dem Hapten-markierten Antikörper, verwendet werden, um den Analyten in einer Sandwich-Abscheidung Streptavidin. Der Komplex bindet an den Chip durch die anti-hapten/hapten Interaktion. Am Ende eines jeden Testlauf werden die Sensoren mit einer verdünnten Säure ermöglicht die sequentielle Analyse von Spalten aus einer 96-Well-Platte gereinigt.
Hier präsentieren wir die Methode zur Entwicklung eines benutzerdefinierten CHO-HCP AMMP Assay für Bioprozess-Entwicklung. Die Entwicklung AMMP Assays oder die Änderung bestehender Assays in AMMP Assays können eine bessere Leistung (Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit) in komplexen Proben und reduzierte Arbeitszeit. Das Protokoll zeigt die Schritte für die Entwicklung und die Diskussion der Bewertungen repräsentative Ergebnisse. Für eine ausführliche Erläuterung der Assay-Optimierung und Anpassung Parameter Kontakt BioScale. Dieses Kit bietet generische Bioprozessentwicklung Assays wie Residual Protein A, Produkt-Titer und CHO-HCP.
Die vorstehenden Beispiele zeigen, AMMP hochempfindliche quantitative Ergebnisse in komplexen Proben. Diese Leistung, wenn sie mit der Leichtigkeit und Kontrolle der Formatierung Reagenzien in das System geliefert wird, für eine Vielzahl von Anwendungen ermöglicht. Diese Anträge können spezifisch für ein Ziel, wie in Gadd34 in Tumor, oder allgemein für ein Spektrum von Zielen, wie sie in Wirtszellprotein Detektion und Quantifizierung in Proben, die die Reinigung Strom zu überqueren. Der geringe Overhead ViBE Plattform mit hochflexiblen AMMP kombiniert ein leistungsstarkes Tool für die Bereitstellung von kritischen Tests.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit | ||||
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required | ||||
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) | ||||
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9) | ||||
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange | ||||
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations | ||||
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab) | ||||
Streptavidin magnetic beads | BioScale | (10 mg/mL) ~108 beads/mg | ||
Magnet for microcentrifuge tubes | New England BioLabs | cat # S1510S | ||
Biotinylated BSA for blocking | ||||
Phosphate buffered saline (PBS) | ||||
PBS 0.1% Tween 20 | ||||
Vortex | ||||
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator | ||||
Antibody or protein to be labeled | ||||
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit | ||||
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required | ||||
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) | ||||
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9) | ||||
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange | ||||
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm. | ||||
Diluent | BioScale | to dilute beads and FlAb | ||
Sample Diluent | BioScale | to dilute samples and calibrators | ||
Running Buffer Additive | BioScale |