माउस टी कोशिकाओं में टी सेल रिसेप्टर्स की रेट्रोवायरल transduction
Summary
हम एक प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं माउस रेट्रोवायरल पारगमन का उपयोग कर उत्पादन प्रोटोकॉल वर्तमान
Abstract
टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) प्रतिरक्षा प्रणाली में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं. टी सेल सतहों पर TCRs विशेष रूप से पेप्टाइड पेश प्रतिजन (APCs) कोशिकाओं 1 द्वारा प्रस्तुत प्रतिजनों की पहचान कर सकते हैं. यह मान्यता टी कोशिकाओं और कार्यात्मक परिणामों (जैसे cytokine उत्पादन लक्ष्य कोशिकाओं की हत्या) की एक श्रृंखला के सक्रियण के लिए होता है. TCRs के कार्यात्मक भूमिका को समझना महत्वपूर्ण है करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली की शक्ति का दोहन करने के लिए इम्मुनोलोगि संबंधित रोगों (जैसे कैंसर या autoimmunity) की एक किस्म के इलाज के.
यह माउस मॉडल में TCRs, जो कई मायनों में पूरा किया जा सकता है है का अध्ययन करने के लिए सुविधाजनक है. बनाना TCR ट्रांसजेनिक माउस मॉडल महंगा है और समय लेने वाली है और वर्तमान में वहाँ केवल उन में से एक सीमित संख्या में 2-4 उपलब्ध हैं. वैकल्पिक रूप से, के साथ चूहों टी कोशिकाओं प्रतिजन विशेष हड्डी कल्पना मज्जा द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है. इस विधि भी कई सप्ताह लगते हैं और 5 विशेषज्ञता की आवश्यकता है. इन विट्रो सक्रिय माउस में टी कोशिकाओं में TCRs के रेट्रोवायरल transduction पेप्टाइड-MHC वांछित विशिष्टता की टी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक त्वरित और अपेक्षाकृत आसान विधि है. टी कोशिकाओं विशिष्ट एंटीजन एक सप्ताह में उत्पन्न किया जा सकता है और किसी भी बहाव के अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया. Transduced टी कोशिकाओं का अध्ययन भी मानव immunotherapy के लिए प्रत्यक्ष आवेदन किया है, मानव टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के रूप में विशिष्ट प्रतिजन TCRs साथ transduced कैंसर के इलाज के लिए 6 एक उभरते रणनीति है.
यहाँ हम एक retrovirally में इन विट्रो सक्रिय माउस टी कोशिकाओं में TCRs transduce प्रोटोकॉल उपस्थित थे. दोनों मानव और चूहे TCR जीनों इस्तेमाल किया जा सकता है. विशिष्ट TCR जीन ले जाने रेट्रोवायरस उत्पन्न कर रहे हैं और माउस विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी के साथ सक्रिय टी कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया. के बाद इन विट्रो विस्तार में transduced, टी कोशिकाओं प्रवाह cytometry से विश्लेषण कर रहे हैं .
Protocol
Discussion
कई चरणों इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. बेनी ई पैकेजिंग सेल लाइन स्वस्थ हालत में रखा जाना चाहिए. यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं μg 1 / एमएल puromycin, 10 μg / एमएल blasticidin रेट्रोवायरल संरचना प्रोटीन अभिव्यक्ति की हानि को रोकने के साथ DMEM माध्यम से एक बार कुछ passaged कर सकते हैं. अभिकर्मक के दिन पर, कक्षों ~ 80% मिला हुआ होना चाहिए. बहुत कुछ या बहुत सारे कोशिकाओं वायरस टिटर को कम कर सकते हैं. वायरस गुणवत्ता सेल लाइनों है कि आसानी से transduced किया जा सकता है पर परीक्षण द्वारा जाँच की जा सकती है. चूंकि TCRs CD3 परिसरों कोशिका की सतह पर व्यक्त करने की आवश्यकता है, हम नियमित 58α-/β- हाइब्रिडोमा 10 कोशिकाओं (एक सेल लाइन है कि अंतर्जात TCR α या β श्रृंखला व्यक्त नहीं करता, लेकिन व्यक्त CD3 जटिल करता है) का उपयोग. हम हाइब्रिडोमा कोशिकाओं के लगभग 100% पारगमन दक्षता प्राप्त जब यह वायरस की सतह पर तैरनेवाला के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं के लिए transducing. अंत में, टी कोशिकाओं को सक्रिय proliferating क्योंकि retrovirus केवल सक्रिय विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित कर सकते हैं की जरूरत है.
विधि विशिष्ट प्रतिजन टी कोशिकाओं के उत्पादन कई सीमाएँ हैं के लिए यहाँ प्रस्तुत किया. सबसे पहले, यह मुश्किल है प्राथमिक माउस टी कोशिकाओं के लिए 100% पारगमन क्षमता तक पहुँचने के लिए. कोशिकाओं के एक हिस्से ब्याज की TCR व्यक्त नहीं. दूसरा, TCR α transduced और β चेन अंतर्जात TCRs के साथ 9 mispair कर सकते हैं, जो ब्याज की TCR की अभिव्यक्ति के स्तर को कम कर सकते हैं . इसके अलावा, mispaired TCRs 11 vivo में autoimmunity के कारण हो सकता है . अंत में, वहाँ केवल एक सीमित समय सीमा transduced टी कोशिकाओं को इस्तेमाल किया जा सकता है. एक सप्ताह के आसपास के बाद, कोशिकाओं जा रहा है फिर उत्तेजित जब तक apoptosis से गुजरना. हालांकि, कोशिकाओं समाप्त हो और दोहराव पुनः stimulations के साथ कार्य खो सकता है.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच (5U01CA137070) से अनुदान और अमेरिकन कैंसर सोसायटी (RSG-09-070-01-LIB), एक कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट अन्वेषक पुरस्कार (एम के), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के पूर्व डॉक्टरेट फैलोशिप (किमी) और के द्वारा समर्थित किया गया एक स्पेनिश मंत्रालय शिक्षा और विज्ञान फैलोशिप (APG) के.
हम प्रोटोकॉल के लिए उपयोगी सुझाव के लिए धन्यवाद डॉ. निकोलस Restifo और डॉ. Zhiya यू (NIH / NCI) करना चाहते हैं.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CD8a+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | ||
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | ||
| Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | ||
| 1x PBS (no calcium or magnesium) | Invitrogen | 10010-049 | ||
| Ack lysing buffer | Invitrogen | A10492-01 | ||
| Recombinant human IL2 | Peprotech | 200-02 | ||
| Anti-CD3e antibody | BD Bioscience | 553057 | ||
| Anti-CD28 antibody | BD Bioscience | 553294 | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
| Plat-E Packaging cell line | Cell Biolabs | RV-101 | ||
| OptiMEM medium | Invitrogen | 31985-062 | ||
| 10cm Poly-lysine coated plates | BD Bioscience | 356469 | ||
| pCL-Eco helper plasmid | Imgenex | 10045P | ||
| Protamine sulfate | APP Pharmaceuticals | 22905 | ||
| DMEM | Invitrogen | 12491-023 | ||
| FBS | Hyclone | SH3008803 | ||
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Invitrogen | 15140-122 | ||
| L-Glutamine | Invitrogen | 35050-061 | ||
| Sodium Pyruvate Solution | Invitrogen | 11360-070 | ||
| Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140-050 | ||
| RPMI | Invitrogen | 12633-020 | ||
| β- Mercaphoethanol | Invitrogen | 21985-023 |
Media:
DMEM medium (DMEM +10% heat inactivated FBS + Pen/Strep + L-Glu+ Sodium Pyruvate + Non-essential amino acid).
DMEM medium without Pen/Strep (Same as DMEM medium, but without adding Pen/Strep).
RPMI medium (RPMI +10% heat inactivated FBS + L-Glu + Non-essential amino acid + β- Mercaphoethanol + Pen/Strep+ Sodium Pyruvate).
Referencias
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