마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

1. Retroviral 구축 준비 retroviral 벡터에 관심있는 T – 세포 수용체 (TCR) 유전자 (그림 1, 7 pMSG 예를 들어 벡터, pMIGII 5,8, Cellbiolabs에서 pMXs)을 하위 클론. TCR α와 β 사슬 유전자가 같은 표현을 보장하기 위해 동일한 모터의 제어하에 동일한 벡터에해야합니다. 관심 TCR 인간있다면, 인간의 지속적인 도메인은 마우스를 지속적으로 도메인 9 대체해야합니다. 우리의 관측은 전체 길이가 인간의 TCRs가 안정적으로 마우스 T – 세포에 표현하지됩니다. Qiagen 맥시 준비 키트 또는 유사한 제품을 사용 고품질의 플라스미드 DNA를 준비합니다. 플라스미드의 농도가 1 μg 주변 / μL에서해야합니다. 2. Transfection 및 T – 세포 절연 일 -1 (플레이트 포장 세포) 플래티넘 – E (플랫 – E, Cellbiolabs) 트립신 – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)로 retroviral 포장 세포를 이동시키다과 DMEM 매체와 중화. 5 분 1000 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 DMEM 미디어 세포 펠렛을 resuspend. 휴대폰 번호를 결정하고 0.6×10 6 / ML에서 세포를 희석. 플레이트 10 A 10mm 폴리 – 라이신 코팅 조직 문화 플레이트의 세포 현탁액의 ML 37에서 세포 배양기에서 하룻밤 성장 ° C 5 % CO 2. 데이 0 (Transfection) 다음날 아침, 가벼운 현미경으로 세포를 검사합니다. 세포는 약 80 % 합류한다. 부드럽게 접시에서 미디어를 제거합니다. 1X PBS로 세포를 한 번 씻고 페니실린 – 스트렙토 마이신 (펜 / Strep)없이 10 ML 사전 예열 신선한 DMEM 미디어를 추가할 수 있습니다. (참고 : 펜 / Strep transfection를 방해할 수) transfection 복합을 준비합니다. A와 B 아래와 같이 혼합 준비 : 플라스미드 DNA : A 믹스 9 μg 플라스미드 PCL – 에코 도우미 6.3 μg OptiMEM 1.5 ML 믹스 B : Lipopfectime 2000 60 μL OptiMEM 1.5 ML 상온에서 5 분 별도로 A와 B를 품어 부드럽게 A와 B 함께 믹스와 transfection 단지를 형성하기 위해 상온에서 20 분 동안 품어. 천천히 플랫 – E 세포로 혼합 (총 3 ML) 똑. 부드럽게 골고루 transfection 혼합물을 배포하는 앞뒤 판 바위. 37 세포를 품어 ° 세포 배양기에서 C / 5 % CO 2. 6~8시간 후, 바이러스 생산을위한 신선한 DMEM 매체 10 ML (펜 / Strep와 함께)로 매체를 바꿉니다. 항체와 코트 플레이트 마우스 T – 세포는 바이러스성 전달되기 전에 활성화해야합니다. T – 세포를 활성화하기 위해 다양한 방법이 있습니다. 여기 플레이트 바운드 안티 CD3e 및 안티 CD28 항체를 사용합니다. 1 μg / ML 방지 CD3e의 2 μg / 멸균 PBS에 항 CD28의 ML의 항체 혼합물을 준비합니다. 24 잘 조직 문화 판의 각 잘하는 항체 혼합물 250 μL를 분배. 번호판이 37 4 ° C 또는 2 시간에 밤새 코팅 수 있습니다 ° C. 마우스 비장에서 단일 세포 현탁액의 준비 수확 마우스 비장 및 RPMI 매체로 전송할 수 있습니다. 셀 스트레이너에있는 비장를 놓습니다. 5cm 조직 문화 판에 주사기의 플런저와 매쉬은 비장. 멸균 PBS로 세포 스트레이너에서 세포를 씻어. 1000 XG, 5 분 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오. ACK lysing 버퍼에 Resuspend 세포 펠릿 (비장 당 2 ML). 상온에서 2-3 분 알을 품다. 20 ML에 RPMI 매체를 추가하고 5 분 1000 XG를 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오. 멸균 PBS에서 Resuspend 세포 펠릿. 4 5 분 핸드폰 번호와 원심 분리기 1000 XG ° C.를 결정 T – 세포의 고립을 진행합니다. 마우스 T – 세포의 분리 및 활성화 자기 (磁 气) 제품 설명서 (CD8 Miltenyi Biotec에서 + T – 세포 격리 키트)에 따라 세포를 라벨. m의 LS 칼럼 (Miltenyi Biotec)를 플레이스agnetic 분야. 칼럼에 표시된 세포 현탁액을 적용합니다. (마우스 CD8 + T – 세포를 풍부)를 통해 흐름을 수집합니다. 제품 설명서에 따라 3 ML 버퍼로 열 세 번 씻고 흐름을 통해 이전과 결합. 안티 CD3e 및 안티 CD8a 항체와 세포를 얼룩 및 유동세포계측법 (그림 2A)에 의해 분석할 수 있습니다. 전형적인 분리, 전체 세포의 ~ 80-10%는 격리 될 수 있습니다. ~ 고립된 세포의 90 %는 CD8 + T – 세포 수 있습니다. 1000 XG, 5 분에서 세포를 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오. 재조합 인간 IL – 2 (rhIL2, 20 NG / ML) 1×10에서 6 / ML로 RPMI 매체에있는 세포 펠렛을 Resuspend. 그냥 세포를 추가하기 전에, 접시 (2.11 이전에 준비)에서 항체 솔루션을 제거합니다. 무균 PBS 및 제거 PBS 각 잘 린스. 각각 잘 수있는 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 37 ° C / 5 % 나 세포 배양기의 CO 2의 접시를 넣어. 3. 활성의 (제 2 일 및 3 일) 감염 T – 세포 바이러스 생산 2 일 후에, 플랫 – E 셀 플레이트의 매체가 노란색이 될 것입니다. 15 ML 원뿔 관에 바이러스 뜨는을 전송합니다. 추가로 바이러스 제작 (옵션)에 대한 판에 신선한 DMEM 매체 10 ML을 추가합니다. 세포의 파편을 제거하는 5 분 1000 XG에 바이러스 뜨는을 원심 분리기. 새로운 튜브에 바이러스 뜨는을 신중하게 전송합니다. 튜브의 맨 아래에 몇 가지 액체를두고 세포의 파편을 방해하지 않습니다. 수집은 접시에서 50 ML 원뿔 관에 T – 세포를 활성화. 휴대폰 번호를 확인합니다. 부정 (취소 – transduced) 제어로 사용하기 위해 별도의 튜브에 몇 가지 세포를 저장합니다. 5 분 1000 XG에 원심 분리기 및 뜨는 폐기. 20 NG / ML rhIL2 10 μg / 프로타민 황산의 ML 1 ML 당 10 6 세포에 바이러스가 뜨는에서 세포 펠렛을 Resuspend. 24 잘 접시의 각 웰에 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. rhIL2과 프로타민 황산 같은 금액과 같은 세포 밀도에서 RPMI 매체에서 제어 튜브에 세포를 Resuspend. 같은 접시에 세포를 추가합니다. 플라스틱 필름과 접시를 넣어. 없이 브레이크와 32 ° C에서 2000 년 XG에서 90 분 원심 분리기. 원심 분리 후, 플라스틱 필름을 제거합니다. 각 물론 20 NG / ML rhIL2 신선한 RPMI 매체 1 ML을 추가합니다. 인큐베이터에 다시 접시를 넣어. (선택 사항) TCR 높은 표현 수준은 바이러스 표면에 뜨는를 수집하고 3 일에 감염 절차를 반복하여 얻을 수 있습니다. 4. 셀 확장 및 전달의 효율성 평가 검사 일일 T – 세포 transduced. 1시 3분 비율 필요한 경우 RPMI 배지 rhIL2에서에서 세포를 분리. 세포의 자라다를 (중간 노란색 전환)시키지 마십시오. 일 6 일 7, 항체 및 T – 세포 표면에 TCR의 표현을 평가할 수있는 TCR 특정 MHC의 tetramer로 세포를 얼룩. 사용 제어와 같은 T – 세포 (그림 2C) UN – transduced. T – 세포 transduced 추가 하류 어플 리케이션을위한 준비가되어 있습니다. 5. 대표 결과 그것은 splenocytes가 정화없이 transduced 수 있지만 전달하기 전에 T – 세포 집합을 정화하는 것이 유리합니다. 고순도 T – 세포 집합은 상업 자기 구슬을 (그림 2A)를 사용하여 얻을 수 있습니다. T – 세포에 TCRs의 표현 수준을 평가하기 위해, TCR 알파 또는 베타 체인에 대한 특정 항체를 사용할 수 있습니다. 일반적으로 세포의 30 % ~ 80 %가 표현할 수있는 TCR의 유전자 및 바이러스 titers에 따라 TCR (그림 2B)은 transduced. TCR에 대한 MHC tetramer의 특정도 더욱 TCRs의 기능 표현 (그림 2C)를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1. T – 세포 수용체 유전자의 예 구성 하위 복제 retroviral 벡터로. 전체 길이 알파 및 베타 사슬 유전자가 자체 cleavable 2A의 펩티드 링커 8 시까지 연결되어 있습니다. 그림 2. 마우스 T – 세포의 성공적인 고립과 전달의 예. (A) CD8 T – 세포 CD8a + T 세포 격리 키트 (Miltenyi Biotec) 및 안티 CD3e 및 안티 CD8a 항체 물들일를 사용 splenocytes에서 고립되었다. 209 안티 인간 Vbeta 8 항체 (B)와 HLA – A2kb gp100 tetramer (C)와 -217 4 펩타이드와 스테인드 : CD8 T – 세포를 격리하는 것은 인간의 gp100에 대한 구체적인 R6C12 TCR과 transduced되었습니다.