マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

1。レトロウイルスコンストラクトを準備レトロウイルスベクター（図1、7 PMSG例のベクトル、pMIGII 5,8、CellbiolabsからpMXs）に興味のあるT細胞受容体（TCR）遺伝子をサブクローン。 TCRαおよびβ鎖遺伝子は同じ発現を保証するために、同じプロモーターの制御下にある同じベクトル上に存在する必要があります。興味のTCRが人間である場合、ヒト定常ドメインは、マウスの定常領域9によって置き換える必要があります。私たちの観察は、その全長ヒトTCRのが安定してマウスのT細胞に発現しないです。 キアゲンマキシプレップキットまたは類似の製品を使用して高品質のプラスミドDNAを準備します。プラスミドの濃度は約1μg/μLのになっているはず。 2。トランスフェクションとT細胞の分離デイ-1（プレートのパッケージング細胞） トリプシン- EDTAでプラチナ- E（PLAT – E、Cellbiolabs）レトロウイルスパッケージング細胞を取り除くとDMEM培地で中和する。 5分間1,000 × gで細胞を遠心分離します。上清を吸引除去し、DMEM培地で細胞ペレットを再懸濁します。 細胞数を決定し、0.6×10 6 / mLで細胞を希釈する。プレート10 10ミリメートルポリリジンコートした組織培養プレートに細胞懸濁液の添加および37℃で細胞インキュベーターで一晩増殖° C、5％CO 2。 0日目（トランスフェクション） 翌朝、光学顕微鏡下で細胞を調べます。細胞は約80％コンフルエントにする必要があります。 静かにプレートからメディアを取り外します。 1 × PBSで細胞を1回洗浄し、ペニシリン – ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）なしで10 mLを予め温めておいた、新鮮なDMEM培地を加える。 （注：ペン/咽頭トランスフェクションに干渉することができます） トランスフェクション複合体を準備する。 次のようにAとBを混ぜる準備します。 プラスミドDNA：ミックス 9μgのプラスミドPCL -エコヘルパー 6.3μgの OPTIMEM 1.5 mLのミックスB：Lipopfectime 2000 60μL OPTIMEM 1.5 mLの室温で5分間別々にAとBをインキュベート優しく一緒にAとBを混ぜ合わせ、トランスフェクション複合体を形成するために、室温で20分間インキュベートする。 ゆっくりPLAT – E細胞に混合物（合計3 mL）を滴下。ゆっくりと均等にトランスフェクション混合物を配布するために、プレートを前後揺らし。 37細胞をインキュベート° C / 5％セルインキュベーターのCO 2。 6-8時間後に、ウイルス産生のための新鮮なDMEM培地（ペン/連鎖球菌を含む）の10mLで培地を交換してください。 抗体でコーティングプレートマウスT細胞はウイルスの形質導入の前にアクティブにする必要があります。 T -細胞を活性化するために、さまざまの方法があります。ここでは、プレート結合抗CD3eと抗CD28抗体を使用してください。抗CD3eと滅菌PBSで抗CD28の2μg/ mLの1μg/ mLの抗体の混合物を準備します。 24ウェル組織培養プレートの各ウェルに抗体の混合物の250μLを分注します。プレートは4℃で一晩コーティングすることができます℃または37℃で2時間をマウスの脾臓からの単一細胞懸濁液の調製収穫のマウスの脾臓およびRPMI培地への転送。 セルストレイナーで脾臓を置きます。マッシュ5 cmの組織培養プレートにシリンジのプランジャーと脾臓。滅菌PBSで細胞ストレーナーから細胞をすすいでください。 1000年XG、5分間遠心します。 上清を捨てる。 ACK溶解緩衝液で再懸濁し、細胞ペレット（脾臓あたり2 mL）で。室温で2〜3分インキュベートします。 20 mLのにRPMI培地を加え、5分で1000 × gで遠心する。 上清を捨てる。滅菌PBSで再懸濁し、細胞ペレット。細胞数を決定し、4℃で5分間1000 × gでの遠心℃にT細胞の分離に進んでください。 マウスT細胞の単離と活性化磁気製品の取扱説明書（Miltenyi Biotec社からCD8 + T細胞単離キット）にしたがって細胞を標識する。 mのLSカラム（Miltenyi Biotec社）を配置agneticフィールド。カラムに標識細胞懸濁液を適用する。 （マウスCD8 + T細胞を豊かに）、フロースルーを収集する。製品のマニュアルにしたがって3 mLのバッファーでカラムを3回洗浄し、フロースルー前で組み合わせる。 抗CD3eと抗CD8a抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリー（図2a）で分析する。典型的な分離のために、全細胞の〜80〜10パーセントを単離することができる。 〜単離された細胞の90％はCD8 + T細胞です。 1000年XG、5分で細胞を遠心分離します。上清を捨てる。 1 × 10 6 / mLで組換えヒトIL – 2（rhIL2、20 ng / mL）を含むRPMI培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 単にセルを追加する前に、プレート（2.11で事前に準備された）から抗体溶液を除去。滅菌PBSと削除PBSで各ウェルを洗浄します。 各ウェルに細胞懸濁液1 mLを追加します。 37℃/ 5％セルインキュベーターのCO 2でプレートを置く。 3。活性化T細胞の（2日目と3日目）感染ウイルス産生の2日後、PLAT – E細胞プレートの培地が黄色になるはず。 15 mLコニカルチューブにウイルス上清を移す。さらにウイルス産生（オプション）用のプレートに、新鮮なDMEM培地10mLを追加します。 細胞片を除去するために5分間1,000 × gでウイルス上清を遠心してください。慎重に新しいチューブにウイルス上清を移す。チューブの底にある液体のままにして、細胞の残骸を乱すことがありません。 プレートから50 mLコニカルチューブにT細胞活性化集める。細胞数を決定します。ネガティブ（非形質導入）コントロールとして使用される別々のチューブにいくつかのセルを保存。 5分間1,000 × gで遠心すると上清を捨てる。 硫酸プロタミンの20 ng / mLのrhIL2および10μg/ mLの1 mL当たり10 6個の細胞でウイルス上清中の細胞ペレットを再懸濁します。 24ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液1 mLを追加します。 rhIL2と硫酸プロタミンの同量で同じ細胞密度でのRPMI培地でのコントロールのチューブに細胞を再懸濁します。同じプレートにセルを追加。 プラスチックフィルムとプレートを包みます。ブレーキなしで32℃で、2000 × gで90分間遠心します。 遠心分離後、プラスチックフィルムを取り外します。各ウェルに20 ng / mLのrhIL2と新鮮RPMI培地1 mLを追加します。インキュベーターにバックプレートを置く。 （省略可能）TCRの高い発現レベルは、ウイルス上清を収集し、3日目に感染症の手順を繰り返すことによって達成することができます。 4。細胞の増殖と形質導入効率の評価毎日T -細胞形質を調べます。 1時03分比、必要なときRPMI培地rhIL2の時にセルを分割する。細胞の生い茂るを（培地が黄色に変わる）ようにしてください。 6日目または7日目では、抗体とT細胞の表面上のTCRの発現を評価するためにTCRのための特定のMHCテトラマーで細胞を染色。使用してコントロールとしてT細胞（図2c）非形質導入。 T -細胞形質導入は、さらに下流のアプリケーションのための準備が整いました。 5。代表的な結果脾細胞を精製せずに形質導入​​することができますが、それは伝達の前にT細胞サブセットを精製することがしばしば有利である。高純度のT細胞サブセットは、商業的な磁気ビーズを（図2a）を使用して取得できます。 T細胞上のTCRの発現レベルを評価するために、TCRのαまたはβ鎖に特異的な抗体を使用することができます。一般的に細胞の30％〜80％が発現することができるTCR遺伝子とウイルスの力価に応じて、TCR（図2b）を導入した。 TCRのためのMHCテトラマー特定はさらにTCRの機能的発現（図2c）を確認するために使用することができます。 図1。 T細胞受容体遺伝子の例は、構築するサブクローン化レトロウイルスベクターに。全長αおよびβ鎖の遺伝子は、自己開裂可能な2Aのペプチドリンカー8によってリンクされています。 図2。マウスのT細胞の正常な分離と伝達の例は、。（）CD8 T細胞は、CD8a + T Cellアイソレーションキット（Miltenyi Biotec社）と抗CD3eと抗CD8a抗体で染色を用いて脾細胞から単離した。抗ヒトVbeta 8抗体（B）およびHLA – A2kb gp100四量体（c）と209 -217 4ペプチドとステンドグラス：CD8 T細胞の単離されたヒトgp100のためのR6C12 TCR特異的に導入した。