Summary

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Published: November 16, 2010
doi:

Summary

Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Abstract

Uno de los objetivos más importantes de la neurociencia es comprender las señales moleculares que dan instrucciones a las primeras etapas de la formación de sinapsis. Como tal, se ha convertido en imprescindible para desarrollar métodos objetivos para cuantificar los cambios en la conectividad sináptica. A partir de la fijación de la muestra, este protocolo detalles de cómo cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores. El número de estos colocalizations se cuantifica mediante un enchufe en el Analizador de puntos lagrimales (escrito por Bary Wark, disponibles bajo petición, c.eroglu cellbio.duke.edu @) en la plataforma de software ImageJ análisis. El ensayo de sinapsis se describe en este protocolo se puede aplicar a cualquier tejido neural preparación o la cultura para los que tiene marcadores selectivos de pre-y post-sinápticas. Este ensayo sinapsis es una herramienta valiosa que puede ser ampliamente utilizada en el estudio del desarrollo sináptico.

Protocol

Soluciones para preparar: Anticuerpos Buffer: 150 mM NaCl 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat No:. BP152-5, 50 mM) – 1,21 g 1% de BSA (Sigma, Cat No:. A2153, 1%) – 2,0 g 100 mM de L-lisina (Sigma, Cat No:. L-1137, 100 mM) – 3,65 g Ajustar el pH a 7.4 0,04% de azida Ajuste el volumen a 200 ml con agua destilada H 2 O. Filtrar a través de 0.22μm de filtro (Millipore, Cat No:. SCGPU02RE). PFA diluy…

Discussion

El ensayo de sinapsis se ha descrito anteriormente se basa en el contexto de nuestros objetivos experimentales, en el que nos centramos principalmente en las proyecciones de excitación de la CGR, ya sea en la cultura purificada o en la sección del cerebro. Hemos proporcionado un listado de anticuerpos tabla de referencia que funcionan bien para el etiquetado de las sinapsis excitadoras (Tabla 1).

Este ensayo sinapsis pueden ser adaptados para cuantificar el número de sinapsis de una pobla…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

En el laboratorio de Ben A. Barres (Stanford University).: Puntos lagrimales Plug-in para la imagen J fue escrito por Barry Wark (Consultoría Physion dirección actual) Analizador

Financiación;

  • Alfred P. Sloan Foundation
  • El A. Esther y José Klingenstein Fund Inc.,
  • Fundación Broad Investigación Biomédica
  • Cura para la Iniciativa de la Enfermedad de Huntington s

Materials

  Antigen Species Monoclonal/Polyclonal Vendor Catalog Number Dilution Works in Culture Works in Sections
Presynaptic Synapsin Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 106004 1:750 Y N.D.
Synapsin Mouse Monoclonal Synaptic Systems 106001 1:500 Y Y
Bassoon Mouse Monoclonal Assay Designs VAM-PS003F 1:500 Y Y
Bassoon Guinea Pig Polyclonal Synaptic Systems 141004 1:1000 Y N.D.
Synaptotagmin 1 Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 105002 1:750 Y N
Synaptobrevin 2
(C1.69.1)
Mouse Monoclonal Synaptic Systems 104211 1:500 Y Y
Synaptophysin
(C1.7.2)
Mouse Monoclonal Synaptic Systems 101011 1:500 Y Y
VGlut1 Mouse Monoclonal Millipore MAB5502 1:2500 N Y
VGlut1 Guinea pig Polyclonal Millipore AB5905 1:2500 N Y
VGlut2 Guinea pig Polyclonal Millipore AB2251 1:2500 N Y
Postsynaptic PSD-95
(6G6-1C9 clone)
Mouse Monoclonal Affinity Bio Reagents MA1-045 1:750 Y N
PSD-95 Rabbit Polyclonal Zymed 51-6900 1:500 N Y
Homer Mouse Monoclonal Synaptic Systems 160011 1:500 Y N.D.
Homer Rat Polyclonal Millipore AB5875 1:500 Y Y
Gephyrin Rabbit Polyclonal Synaptic Systems 147003 1:500 Y Y
Gephyrin Mouse Monoclonal Synaptic Systems 147 1:200 Y Y

Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined.

Reagent Company Cat. No.
PBS Invitrogen 20012-027
poly-d-lysine Sigma P6407
Laminin Cultrex 3400-010-01
Triton X-100 Roche Diagnostics Gmbh 9002-93-1
Normal Goat Serum Gibco 16210
VectaShield with DAPI Vector Laboratories H-1200
OCT Tissue-Tek 4583
Tris-Base (50 mM) Fisher BP152-5
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
l-lysine Sigma L-1137
16% PFA solution Electron Microscopy Sciences 15711
Granular PFA Electron Microscopy Sciences 19210
24-well culture plate Falcon 35-3047
Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies Invitrogen
Supply Company Cat. No.
12mm, No. 0 glass coverslips Karl Hecht Gmbh 1105209
No. 1.5 glass coverslip (for slices) VWR Scientific 48393241
Glass slides VWR Scientific 48311-703

Referencias

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Citar este artículo
Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. J. Vis. Exp. (45), e2270, doi:10.3791/2270 (2010).

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