Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse
Summary
Questo protocollo dettagli come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori.
Abstract
Uno degli obiettivi più importanti nel campo delle neuroscienze è quello di capire i segnali molecolari che istruire prime fasi della formazione di sinapsi. Come tale, è diventato imperativo per sviluppare approcci obiettivo di quantificare i cambiamenti nella connettività sinaptica. A partire dalla fissazione del campione, il presente protocollo come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori. Il numero di questi colocalizations è quantificati tramite un plug-in puncta Analyzer (scritto da Bary Wark, disponibile su richiesta, c.eroglu cellbio.duke.edu @) sotto la piattaforma software di analisi ImageJ. Il dosaggio sinapsi descritte in questo protocollo può essere applicato a qualsiasi preparazione del tessuto neurale o della cultura per cui si è selettivo marcatori pre-e post-sinaptici. Questo test sinapsi è uno strumento prezioso che può essere ampiamente utilizzato nello studio dello sviluppo sinaptico.
Protocol
Discussion
Il test sinapsi di cui sopra si basa nel contesto dei nostri obiettivi sperimentali, in cui ci si concentra in gran parte su proiezioni eccitatori di RGCs, sia in purificati cultura o nella sezione del cervello. Abbiamo fornito una tabella che elenca gli anticorpi di riferimento che funzionano bene per l'etichettatura sinapsi eccitatorie (Tabella 1).
Questo test sinapsi può essere adattata a quantificare il numero delle sinapsi neuronali di ogni popolazione o di qualsiasi altro sottotip…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nel laboratorio di A. Ben Barres (Stanford University).: Puncta Plug-in per immagini è stata scritta da Barry J Wark (Consulting Physion attuale indirizzo) Analyzer
Finanziamento;
- Alfred P. Sloan Foundation
- A. Esther e Giuseppe Klingenstein Fund, Inc.
- Broad Fondazione per la Ricerca Biomedica
- Cura per la malattia di Huntington iniziativa s
Materials
| Antigen | Species | Monoclonal/Polyclonal | Vendor | Catalog Number | Dilution | Works in Culture | Works in Sections | |
| Presynaptic | Synapsin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 106004 | 1:750 | Y | N.D. |
| Synapsin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 106001 | 1:500 | Y | Y | |
| Bassoon | Mouse | Monoclonal | Assay Designs | VAM-PS003F | 1:500 | Y | Y | |
| Bassoon | Guinea Pig | Polyclonal | Synaptic Systems | 141004 | 1:1000 | Y | N.D. | |
| Synaptotagmin 1 | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 105002 | 1:750 | Y | N | |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) |
Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 104211 | 1:500 | Y | Y | |
| Synaptophysin (C1.7.2) |
Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 101011 | 1:500 | Y | Y | |
| VGlut1 | Mouse | Monoclonal | Millipore | MAB5502 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut1 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore | AB5905 | 1:2500 | N | Y | |
| VGlut2 | Guinea pig | Polyclonal | Millipore | AB2251 | 1:2500 | N | Y | |
| Postsynaptic | PSD-95 (6G6-1C9 clone) |
Mouse | Monoclonal | Affinity Bio Reagents | MA1-045 | 1:750 | Y | N |
| PSD-95 | Rabbit | Polyclonal | Zymed | 51-6900 | 1:500 | N | Y | |
| Homer | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 160011 | 1:500 | Y | N.D. | |
| Homer | Rat | Polyclonal | Millipore | AB5875 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Rabbit | Polyclonal | Synaptic Systems | 147003 | 1:500 | Y | Y | |
| Gephyrin | Mouse | Monoclonal | Synaptic Systems | 147 | 1:200 | Y | Y |
Table 1: Lists examples of good pre- and postsynaptic markers that we have successfully utilized in our synapse assay. Be aware that this is not an exhaustive list of all available markers. Y = Yes, N = No, N.D. = Not Determined.
| Reagent | Company | Cat. No. |
| PBS | Invitrogen | 20012-027 |
| poly-d-lysine | Sigma | P6407 |
| Laminin | Cultrex | 3400-010-01 |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 |
| Normal Goat Serum | Gibco | 16210 |
| VectaShield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher | BP152-5 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 |
| l-lysine | Sigma | L-1137 |
| 16% PFA solution | Electron Microscopy Sciences | 15711 |
| Granular PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
| 24-well culture plate | Falcon | 35-3047 |
| Goat anti-mouse Alexa conjugated antibodies | Invitrogen | — |
| Supply | Company | Cat. No. |
| 12mm, No. 0 glass coverslips | Karl Hecht Gmbh | 1105209 |
| No. 1.5 glass coverslip (for slices) | VWR Scientific | 48393241 |
| Glass slides | VWR Scientific | 48311-703 |
Referencias
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