Summary

Антиген Конкретные В Vivo Убийство методом с использованием меченых клеток CFSE Целевая

Published: November 09, 2010
doi:

Summary

Многие инфекции вызывают сильные CTL ответ, но время от времени, количество ответ клеток не коррелирует с контролем патогена<sup> 1</sup>. Одним из показателей качества CTL является их способность убивать специально<sup> 2</sup>. CFSE маркировки клеток-мишеней может быть использован для расследования этого CTL качество ответа<em> В естественных условиях</em<sup> 3,4</sup>.

Abstract

Карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил эфира (CFSE) можно использовать, чтобы легко и быстро этикетке клеточной популяции интерес для прижизненного исследования. Это наклеивания этикеток классически были использованы для изучения пролиферации и миграции. В методе, представленных здесь, мы сократили сроки после приемных передачи смотреть на выживание и убийство эпитопа конкретных CFSE меченых клеток-мишеней 4-6. Уровень удельной убийство CD8 + Т-клеток клона может указывать на качество ответа, так как их количество может быть обманчивым. Конкретные CD8 + Т-клеток может стать функционально исчерпаны в течение долгого времени со снижением продукции цитокинов и убийства 7,8. Кроме того, некоторые клоны CD8 + Т-клеток, возможно, не убивать, а также другие с различными TCR особенности 9. Для эффективного иммунитета опосредованного Cell (ММК), антигены должны быть идентифицированы, которые производят не только достаточное число ответ Т-клеток, но и функционально надежный ответ Т-клеток. Здесь мы оцениваем процентов ячейке конкретных убийство двух пептидных специфических Т клеточных клонов в BALB / с мышами.

Protocol

1. Выявление целевой конкретным Эффектор ЦТЛ путем иммунизации (день 0) Прежде чем начать, принять решение о конкретных эффекторных: целевой системе. В этом примере классического анализа в естественных условиях CTL, мы будем использовать очищенные пептидные иммунизации для вы?…

Discussion

Этот анализ может быть изменен, чтобы исследовать способность к пролиферации клеток, в том числе клональной экспансии, потому что CFSE делится поровну между относительно потомства 10,11. Кроме того, можно использовать CFSE маркировки для расследования миграции клеток 6,12, хотя Ес?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Я хотел бы поблагодарить Бьянка Мот, Карла Oseroff, и Мари-Франс DelGuercio для введения мне иммунологических анализов и мышь обработки. Работа в лаборатории Г. А. Splitter финансируется за счет гранта NIH 1-RO1-AI-073558, GLRCE грант 1-U54-AI-057153, а BARD американо-3829-06.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
1 mm glass beads   Biospec Products 11079110  
70 μm cell strainer   BD Falcon 352350  
96-well plate   Costar 3799  
Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant   Pacific Immunology n/a  
DMSO   Sigma D-5879  
FBS   GIBCO 16000-077  
FC 500 Flow Cytometer   Beckman Coulter n/a  
Kontes glass tissue grinder   Kontes 885300-0015  
Mini Beadbeater   Biospec Products n/a  
Needle   B-D 305175  
Parafilm “M”   Pechiney Plastic Packaging PM992  
Paraformaldehyde   Electron Microscopy Sciences 157-8  
PBS   GIBCO 10010-023  
PharmLyse lysing reagent   BD Biosciences 555899  
RPMI 1640   GIBCO 11875-093  
Syringe   B-D 309602  
Vybrant CFSE Kit   Invitrogen (Molecular Probes) V12883  

Referencias

  1. Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
  2. Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
  3. Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
  4. Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
  5. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  6. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
  7. Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
  8. Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
  9. Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
  10. Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .

Play Video

Citar este artículo
Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells. J. Vis. Exp. (45), e2250, doi:10.3791/2250 (2010).

View Video