Antígeno Específico de la En Vivo Matar ensayo utilizando CFSE células diana marcadas
Summary
Muchas infecciones provocan una respuesta CTL fuerte, pero de vez en cuando, la cantidad de células de respuesta no se correlaciona con el control del patógeno<sup> 1</sup>. Una medida de la calidad del CTL es su capacidad de matar específicamente<sup> 2</sup>. CFSE etiquetado de las células diana pueden ser utilizados para investigar la calidad de la respuesta CTL<em> In vivo</em<sup> 3,4</sup>.
Abstract
Diacetato de carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE) puede ser utilizada para etiquetar con facilidad y rapidez una población celular de interés para la investigación en vivo. Este etiquetado tradicionalmente se ha utilizado para estudiar la proliferación y migración. En el método que aquí se presenta, hemos acortado la línea de tiempo después de la transferencia adoptiva de mirar la supervivencia y la muerte de las células CFSE epítopo específico etiqueta meta 6.4. El nivel de muerte específicas de un clon de células T CD8 + pueden indicar la calidad de la respuesta, ya que su cantidad puede ser engañosa. Específicas de células T CD8 + pueden llegar a ser funcionalmente agotado el tiempo con una disminución en la producción de citoquinas y matando a 7,8. Además, ciertos CD8 + clones de células T no se puede matar, así como otras con diferentes especificidades TCR 9. De la inmunidad mediada por células efectiva (CMI), los antígenos deben ser identificados que producen no sólo un número adecuado de responder las células T, sino también funcionalmente robusto responder las células T. Aquí se evalúa la eliminación de las células específicas por ciento de los dos péptidos clones específicos de células T en ratones Balb / c.
Protocol
Discussion
Este ensayo puede ser modificado para investigar la capacidad proliferativa de las células, incluyendo la expansión clonal, porque CFSE relativamente divide en partes iguales entre la progenie 10,11. También es posible utilizar el etiquetado CFSE para investigar la migración de células 6,12, aunque hay otra célula de seguimiento métodos que pueden ser más apropiados en función de su hipótesis, por ejemplo, tetrámeros y bioluminiscencia 13, que también se puede combinar con el…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Me gustaría agradecer a Bianca Mothé, Oseroff Carla y Marie-France DelGuercio por haberme introducido en ensayos inmunológicos y el manejo del ratón. Trabajar en el laboratorio de GA Splitter es financiado por el NIH subvención 1-SR1-AI-073558, GLRCE conceder 1-U54-AI-057153, y BARD Estados Unidos-3829-06.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | ||
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | ||
| 96-well plate | Costar | 3799 | ||
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | ||
| DMSO | Sigma | D-5879 | ||
| FBS | GIBCO | 16000-077 | ||
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | n/a | ||
| Kontes glass tissue grinder | Kontes | 885300-0015 | ||
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | ||
| Needle | B-D | 305175 | ||
| Parafilm “M” | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | ||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | ||
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | ||
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-093 | ||
| Syringe | B-D | 309602 | ||
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen (Molecular Probes) | V12883 |
Referencias
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse. Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).
- Ingulli, E. Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells. Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).
- Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo. Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
- Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).
- Akondy, R. S. The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response. J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).
- Wallace, P. K. Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution. Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).
- Labadi, A., Balogh, P. Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling. Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).
- Suffner, J. Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice. J Immunol. 184 (4), 1810-1820 .
