Summary

Induktion und Beurteilung der Class Schalter Rekombination in Purified Murine B-Zellen

Published: August 13, 2010
doi:

Summary

Nach Antigen Exposition unterziehen Subpopulationen von aktivierten B-Zellen ein Verfahren, wie class switch Rekombination (CSR) bekannt, dass Antikörper-Isotypen mit unterschiedlichen Effektorfunktionen zu produzieren. Das Protokoll in diesem Bericht beschriebenen erklärt, wie CSR induziert und analysiert werden können<em> In-vitro-</em> Für die Zwecke des Studiums B-Zell-Funktion.

Abstract

Humorale Immunität ist der Zweig des Immunsystems durch B-Zellen gehalten und vermittelt durch die Sekretion von Antikörpern. Bei B-Zell-Aktivierung, erfährt der Immunglobulin-Locus eine Reihe von genetischen Veränderungen, die Bindekapazität und Effektor-Funktion der sekretierten Antikörper verändern. Dieser Prozess wird durch eine genomische Rekombination Veranstaltung als Klasse-Schalter Rekombination (CSR), in denen die Standard-IgM-Antikörper-Isotyp für einen IgG, IgA, IgE oder substituierten bekannt ist hervorgehoben. Jeder Isotyp besitzt verschiedene Effektor-Funktionen wodurch CSR entscheidend für die Aufrechterhaltung der Immunität.

Die Diversifizierung der Immunglobulin-Locus wird durch das Enzym activation-induced Cytidindeaminase (AID) vermittelt. Eine schematische Video beschreibt diesen Prozess im Detail ist online verfügbar (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID-Aktivität und der CSR-Weg werden häufig bei der Beurteilung der B-Zell-Funktion und humoralen Immunität in Mäusen untersucht. Das Protokoll in diesem Bericht beschriebenen präsentiert eine Methode der B-Zell-Isolierung von murinen Milz und nachfolgende Stimulation mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) zu induzieren Klasse Umstellung auf IgG3 (für andere Antikörper-Isotypen siehe Tabelle 1). Darüber hinaus ist das fluoreszierende Zellfärbung Farbstoff Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) verwendet werden, um die Zellteilung der stimulierten Zellen, ein Prozess von entscheidender Bedeutung für Schalt-1, 2 Isotyp zu überwachen.

Die Regulierung der AID und der Mechanismus, durch den CSR auftritt, sind noch unklar und somit in vitro-Klasse-Schalter Assays bieten eine zuverlässige Methode zur Prüfung dieser Prozesse in verschiedenen Mausmodellen. Diese Assays wurden bereits im Zusammenhang mit der Gen-Mangel mit Knockout-Mäusen 3 verwendet. Darüber hinaus können in vitro Schalten von B-Zellen durch virale Transduktion vorangestellt werden, um die Genexpression durch RNA-Zuschlag oder Transgenexpression 4-6. Die Daten aus dieser Art von Experimenten haben unser Verständnis der AID-Aktivität, die Auflösung der CSR-Reaktion und Antikörper-vermittelte Immunität in der Maus beeinflusst.

Protocol

Schritt I: Isolierung von Milz B-Zellen über magnetische Anreicherung Experimentelle Mäuse sollten im Alter von 8-12 Wochen in voller Reifung des Immunsystems zu gewährleisten. Euthanize der Maus durch Genickbruch und genießen in 70% Ethanol. Chirurgisch entfernen Sie die Milz durch einen Einschnitt durch die Haut und Muskulatur der linken Hypochondrium des Bauches und schneiden Sie es in drei großen Stücken in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Sicherstellen, dass alle Werkzeuge und …

Discussion

Das Protokoll skizzierten bietet einen Standard-Test, um AID Expression und Funktion während des Unterrichts Schalten von primären murinen B-Zellen zu analysieren. Dieses Protokoll verwendet bakterielle LPS zu induzieren Wechsel von IgM zu IgG3, obwohl Änderungen an der Stimulation Medien gemacht zu veranlassen, auf andere Isotypen (zusammengefasst in Tabelle 1 8, 9).

Wir haben festgestellt, dass für noch nicht bekannte Gründe, fetales Kälberserum kann das Niveau der Klasse …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind dankbar für die Martin-Labor für hilfreiche Diskussionen. Diese Publikation wird durch einen Zuschuss von der Canadian Institute of Health Research (MOP-89783) unterstützt. AM wird durch einen Canada Research Chair Tier II-Award unterstützt.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
Phosphate Buffered Saline   Gibco 14190  
EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit   Stemcell Technologies 19754  
Polystyrene tubes   Becton Dickinson Falcon 352058  
Bovine Serum Albumin   Sigma Aldrich A7030  
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit   Invitrogen C34554  
Bovine Calf Serum   HyClone SH30072.03  
RPMI 1640 Culture Medium   Gibco 11875  
Lipopolysaccharides from Escherichia coli   Sigma Aldrich L6529  
β-mercaptoethanol   Gibco 21985  
Fetal Bovine Serum   HyClone SH30396.03  
Normal Mouse Serum   Jackson ImmunoResearch 011-000  
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)   Becton Dickinson Pharmingen 553141  
Rat Anti-Mouse IgG3   Becton Dickinson Pharmingen 553401  

Referencias

Play Video

Citar este artículo
Zaheen, A., Martin, A. Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells. J. Vis. Exp. (42), e2130, doi:10.3791/2130 (2010).

View Video