Inducción y evaluación de la recombinación de cambio de clase en las células murinas purificada B
Summary
Después de la exposición al antígeno, las subpoblaciones de linfocitos B activados sufren un proceso conocido como recombinación de cambio de clase (CSR) para producir isotipos de anticuerpos con diferentes funciones efectoras. El protocolo se describe en este informe se explica cómo la RSE puede ser inducida y analizados<em> In vitro</em> A los efectos de estudiar la función de las células B.
Abstract
La inmunidad humoral es la rama del sistema inmune que mantiene las células B y mediado a través de la secreción de anticuerpos. Tras la activación de células B, el locus de la inmunoglobulina se somete a una serie de modificaciones genéticas para alterar la capacidad de unión y función efectora de los anticuerpos secretados. Este proceso se destaca por un evento de recombinación genómica conocida como recombinación de cambio de clase (CSR) en el que se sustituye el isotipo IgM por defecto para un anticuerpo de IgG, IgA o IgE. Cada isotipo posee distintas funciones efectoras con lo que la RSC crucial para el mantenimiento de la inmunidad.
Diversificación de la locus de la inmunoglobulina es mediada por la enzima citidina deaminasa inducida por activación (AID). Un vídeo esquema que describe este proceso en detalle está disponible en línea (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). La actividad de la AID y la vía de RSC son comúnmente estudiados en la evaluación de la función de las células B y la inmunidad humoral en ratones. El protocolo se describe en este informe se presenta un método de aislamiento de células B del bazo murino y posterior estimulación con lipopolisacárido bacteriano (LPS) para inducir el cambio a la clase IgG3 (para otros isotipos de anticuerpos ver Tabla 1). Además, la tinción de células fluorescentes de tinte carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE) se utiliza para controlar la división celular de las células estimuladas, un proceso crucial para el cambio de isotipo 1, 2.
La regulación de la AID y el mecanismo por el que la RSE se produce aún no están claros y por lo tanto es ensayos in vitro de cambio de clase proporcionan un método confiable para las pruebas de estos procesos en modelos de ratones diferentes. Estos ensayos se han utilizado anteriormente en el contexto de la deficiencia de genes utilizando ratones knockout 3. Además, in vitro el cambio de las células B puede estar precedido por la transducción viral para modular la expresión génica mediante ARN derribo o la expresión del transgén 4-6. Los datos de este tipo de experimentos han impactado a nuestra comprensión de la actividad de AID, la resolución de la reacción de la RSE, y la inmunidad mediada por anticuerpos en los ratones.
Protocol
Discussion
El protocolo descrito anteriormente proporciona un estándar de ensayo para analizar la expresión de la AID y la función durante el cambio de clase de primaria de las células B murinas. Este protocolo utiliza bacteriana LPS para inducir el cambio de IgM a IgG3, a pesar de las modificaciones a los medios de estimulación se puede hacer para inducir el cambio a otros isotipos (que se resumen en la Tabla 1 8, 9).
Hemos tomado nota de que, por razones aún desconocidas, suero bovin…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos con el laboratorio de Martin útil para los debates. Esta publicación está apoyada por una subvención del Instituto Canadiense de Investigación en Salud (MOP-89783). AM es apoyado por una investigación de Canadá Premio Cátedra de Nivel II.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
Referencias
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
